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由于基于酶抑制法的農(nóng)藥快速 檢驗中所使用的動物來源的酣酶普遍存在著提取成本高，活 性不穩(wěn)定， 不易于保存的間題。本團隊從蕓豆中篩選并純化出一種植物酣酶。通過底

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本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、及其應用、大量制備豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。如上所述本發(fā)明的發(fā)明人首先利用pcr反應從豇豆基因組dna中直接獲得cpti基因(cpti基因不含有內(nèi)含子)，然后優(yōu)化改造所述cpti序列，改造后的序列在大腸桿菌中的表達量和表達比活性都有顯著改進。

項目成果/簡介:本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、及其應用、大量制備豇豆胰蛋白酶抑制劑的方法。如上所述本發(fā)明的發(fā)明人首先利用pcr反應從豇豆基因組dna中直接獲得cpti基因(cpti基因不含有內(nèi)含子)，然后優(yōu)化改造所述cpti序列，改造后的序列在大腸桿菌中的表達量和表達比活性都有顯著改進。

常見的納米酶大多數(shù)是金屬化合物納米顆粒，其催化活性主要是來自在納米顆粒表面的金屬離子。在自然界中，生物酶的特征表明活性位點和支持、穩(wěn)定活性位點的網(wǎng)絡環(huán)境對于高催化效率同樣重要。通過調(diào)整活性位點的成分和環(huán)境可以實現(xiàn)高的活性和選擇性。水凝膠是一類具有良好生物相容性的三維親水網(wǎng)絡材料，其結構可以有效地保護酶分子活性中心，同時提供更好的底物遷移微環(huán)境，從而實現(xiàn)有效的催化作用，載酶水凝膠材料已成為生物學研究中的熱點。納米凝膠為水凝膠的納米粒子，具有類似于宏觀水凝膠材料的親水網(wǎng)絡及類似流體的傳輸特性，其納米的尺寸可以作為進一步體內(nèi)生物應用的理想載體。在受限的納米空間中實現(xiàn)修飾或組裝以獲得雜化納米凝膠仍然存在挑戰(zhàn)。應對這一挑戰(zhàn)，同濟大學化學科學與工程學院王啟剛團隊從仿生的角度出發(fā)，設計了一種酶催化的原子轉移自由基聚合（ATRPase）和金屬配位交聯(lián)方法成功制備出納米人工多酶凝膠體系。該體系具有模擬超氧化物歧化酶（SOD-like）和過氧化物酶（POD-like）特性，可以實現(xiàn)腫瘤微環(huán)境級聯(lián)催化的響應成像。日前，相關研究成果以“Multienzyme‐Mimic Nanogels Synthesized by Biocatalytic ATRP and Metal Coordination for Bioresponsive Fluorescence Imaging”為題，發(fā)表在國際著名學術期刊 Angewandte Chemie International Edition （《德國應用化學》） 上。同濟大學化學科學與工程學院為該文的唯一通訊作者單位，碩士生齊美園為第一作者，王霞副教授和王啟剛教授為共同通訊作者。 圖1.（a）人工多酶凝膠體系的ATRPase及配位交聯(lián)制備流程（b）模擬SOD和POD級聯(lián)酶催化的腫瘤微環(huán)境響應的熒光成像機制。研究人員首先在納米粒子表面修飾酶催化的原子轉移自由基聚合的引發(fā)劑(-Br)，以具有良好生物相容性的生物酶為催化劑，修飾有雙鍵的賴氨酸（N-acryloyl-L-lysine）為聚合單體，在納米粒子周圍聚合制備得到聚賴氨酸高分子刷，最后通過亞鐵配位交聯(lián)，從而構建出具有多酶活性的人工多酶凝膠體系（如圖1所示）。凝膠體系中高分散的Fe離子一方面作為凝膠網(wǎng)絡的交聯(lián)劑，同時作為模擬酶的活性中心。通過模擬SOD和POD酶，先將腫瘤部位高水平的O 2 ?? 催化轉化為H 2 O 2 ，進一步基于腫瘤部位提升的H 2 O 2 通過級聯(lián)酶催化反應實現(xiàn)腫瘤微環(huán)境響應的安全、高效的腫瘤成像。該人工多酶凝膠體系類似自然的過氧化物酶催化機制不產(chǎn)生羥基自由基，具有低毒性和高生物安全性。同時，ATRPase方法和金屬配位交聯(lián)技術可進一步實現(xiàn)多種納米材料體系的制備，用于藥物輸送和其他生物醫(yī)學應用。該研究成果得到了國家自然科學基金、國家重點研發(fā)計劃等經(jīng)費支持以及中國科學院強磁場科學中心的技術支持。王啟剛教授團隊多年來一直致力于高分子凝膠固定酶技術及其生物診療應用，近5年累計以通訊作者在 Adv.Mater. ,  Nat. Commun. ,  Angew. Chem. Inter. Ed. 等期刊發(fā)表SCI論文50多篇。文獻鏈接：https://www.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202002331  PDF：anie_202002331.pdf課題組網(wǎng)站：https://qgwang.tongji.edu.cn/

磷脂酶 D 是一種用于磷脂改性的工業(yè)化生產(chǎn)用酶，近年來研究較多且效果比較明顯的是通過微生物發(fā)酵的方法獲得磷脂酶 D。磷脂酶 D 主要用于兩個方面：一是從卵磷脂出發(fā)，通過磷酸基轉移反應，制備含量較少的磷脂化合物，如磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）等；二是通過轉移反應合成新的磷脂衍生物，用在藥物學領域。磷脂酰絲氨酸是磷脂中的一種，天然含量稀少，但它是大腦中主要的酸性磷脂，能控制和調(diào)節(jié)細胞膜關鍵蛋白的功能狀態(tài)，提高腦細胞的活力，改善大腦功能、修復大腦損傷，成為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”。本項目通過菌種篩選獲得一株高產(chǎn)磷脂酶 D 的肉桂鏈霉菌菌株。通過發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)酵酶活可達到 10U/mL 以上，可用于 PS、PI 的生產(chǎn)。 

傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，如烷化劑、鉑類試劑、作用于核酸合成的藥物、作用于微管蛋白合成 的藥物等，一般存在毒性較大、選擇性較低等問題，因此，研究尋找安全有效、選擇性較好的 靶向性抗腫瘤藥物具有重大的科學意義和巨大的社會價值。 組蛋白去乙酰化酶 (Histone Deacetylase，HDAC) 是治療腫瘤的新靶標，其抑制劑 Vorinostat (SAHA) 和Romidepsin (FK228) 已分別于2006年和2009年經(jīng)美國FDA批準上市用于治 療表皮T細胞淋巴瘤；該類抑制劑顯示出良好的腫瘤治療效果及較小的毒副作用，是目前最具 前景的抗腫瘤藥物之一。 本項目綜合運用分子動力學模擬、計算機輔助藥物設計、化學合成、藥理學活性測試等 方法，通過“設計－合成/修飾－測試”的多次循環(huán)，開發(fā)了一系列結構新穎的四氫-γ-咔啉骨 架的HDAC抑制劑。該類抑制劑可以有效抑制HDAC總酶及HDAC1的活性，多個化合物的酶 活性都低于50 nM；并且，該系列多數(shù)化合物對Hela、A549、HCT116、K562、MCF-7等腫瘤細 胞株表現(xiàn)出比陽性對照藥物SAHA更高的活性，多個化合物對所測腫瘤細胞株的抑制活性低于 1 μM，而對于人類正常細胞無抑制活性；在動物模型試驗中，代表性化合物對接種Lewis肺癌 荷瘤小鼠模型表現(xiàn)出良好的治療效果，且沒有觀察到明顯的體重變化和毒性反應。因此，該類 HDAC抑制劑可以作為藥物先導化合物用于制備抗腫瘤藥物，為廣大腫瘤病患者帶來福音，也 向開發(fā)我國具有自主知識產(chǎn)權的抗腫瘤藥物邁進一步。 

酶解林蛙油及軟膠囊的制作方法,它涉及林蛙油的酶水解及軟膠囊的制作工藝.本發(fā)明將打勻后的林蛙油和水按(1:35)～(1:45)的重量比例制成水混懸液,在水混懸液中加入木瓜蛋白酶,在加入木瓜蛋白酶的林蛙油酶水解液中再加入胃蛋白酶.將酶解,冷凍干燥后的經(jīng)超微粉碎的林蛙油和加入了大豆磷脂的玉米油按1:1的重量比例,經(jīng)膠體磨研勻,再經(jīng)軟膠囊機壓制成膠囊即得.本發(fā)明采用酶解蛋白質(zhì)的方法,提高了蛋白質(zhì)的吸收率,保持和改進了林蛙油的營養(yǎng)價值和營養(yǎng)結構,改善了其溶解性.使林蛙油軟膠囊的制備工藝更加合理,外觀更加美觀.酶解法與其它水解法相比較,屬溫和水解,只作用于蛋白質(zhì),使其水解成氨基酸或多肽,對林蛙油的其它成分沒有影響.

阿特拉津是常用除草劑，也是內(nèi)分泌干擾劑，降解阿特拉津的酶為阿特拉津氯水解酶，全世界報道其基因僅兩家單位，美國一家，中國南開大學一家。轉阿特拉津氯水解酶基因有三點主要應用價值：轉基因作物在阿特拉津噴施的田地中能正常生長、提高制種純度（如雜交水稻）、修復阿特拉津環(huán)境污染。

其他成果/n一種酶法制備有機菜籽多肽的方法，包括：菜籽蛋白的制備；將菜籽蛋白與蒸餾水按一定料液比混勻，并進行超聲輔助濕熱處理，得到濕熱菜籽蛋白漿液；向濕熱菜籽蛋白漿液中加入三聚磷酸鈉進行超聲輔助磷酸化處理，得到磷酸化菜籽蛋白漿液；調(diào)節(jié)磷酸化菜籽蛋白漿液的pH和溫度，并加入堿性蛋白酶進行超聲輔助酶解，得到一次酶解液；調(diào)節(jié)一次酶解液的pH和溫度，并加入復合風味蛋白酶進行超聲輔助酶解，得到二次酶解液；對二次酶解液進行微波滅酶處理，得到滅酶酶解液，將滅酶酶解液離心得到菜籽多肽清液，再進行冷凍干燥處理，即得成品的有機菜籽多肽。該酶法制備有機菜籽多肽的方法，工藝安全、制備便捷。