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本發明涉及預測重型肝炎病情基因的甲基化狀態檢測的方法及試劑，提取病人外周血單個核細胞 DNA 進行亞硫酸氫鹽修飾后，分別用谷胱甘 肽 S-轉移酶 M3 甲基化（M）特異性和非甲基化（U）特異性引物對進行甲基化 特異性聚合酶鏈式反應，根據擴增產物判斷其甲基化狀態，有助于臨床醫生判 定重型肝炎患者的病情和指導治療。

研發階段/n口蹄疫（FMD）是引起的人及偶蹄動物共患的一種烈急性、高度接觸性、發熱性傳染病。FMD在世界上許多國家流行，造成重大的經濟損失和政治影響。口蹄疫病毒（FMDV）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae），口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），該病毒為單股正鏈小RNA病毒，基因組長約8500個核苷酸，主要由結構基因（P1區）和非結構基因（P2、P3區）等構成。該發明具體涉及一種新的含有口蹄疫病毒主要免疫原性基因的重組偽狂犬病弱毒疫苗株，該毒株屬于豬偽狂犬病毒：Pseudorabi

研發階段/n這是免疫性狀相關基因專利，通過本專利的應用，在豬育種中可以提高豬的免疫力和抗病力，節約醫藥成本，提高經濟效益。

本發明公開了一種端粒酶啟動基因表達方法(Telomerase?Activating gene Expression，Tage)及其應用，該表達方法基于端粒酶可結合并延長DNA分子末端的端粒酶識別序列，合成新的端粒重復序列的特性，將端粒酶特有的生物學功能與人工轉錄因子調控細胞基因表達技術相結合，發展了Tage新方法。Tage技術在細胞中可以有效發生，人工轉錄因子可激活效應基因在端粒酶陽性細胞中的表達，效應基因的表達產物可有效殺滅腫瘤細胞，本發明證明Tage技術可用于殺滅腫瘤細胞，而對無端粒酶活性的細胞

一直以來，自從第二代高通量測序技術開發至今，基因組測序成本已經降低到3000美元，我們馬上就要來到1000 dollar genome 的時代。然而從復雜冗余的基因序列中解讀出與疾病相關，與藥物相關的重要信息，已經成為當前生物信息學已經成為生物信息學中最重要的挑戰。面對該挑戰，程容海等人開發了一個在線的個人基因組解碼平臺（Virtual Pharmacist）。它可以支持分析目前主流的生物信息學數據格式，并且通過該軟件后臺的數據庫和算法，挖掘出個人基因組中的基因突變（Single Nucleotide Polymorphism）與藥物反應的關聯性分析。該平臺只需要用戶上傳SNP數據文件，或者是高通量測序文件便可以自動完成包括生物信息學分析，基因組信息解讀（genomic interpretation），并最終呈現給用戶一份詳細的，用戶友好的，關于195種藥物反應的基因檢測報告。

01.成果簡介 CRISPR/Cas9是細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統。其工作原理是crRNA通過堿基配對與tracrRNA結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。經過研究，通過人工設計tracrRNA/crRNA，改造形成具有引導作用的sgRNA，可以引導Cas9蛋白在多種細胞的特定基因組位點上進行切割、修飾，并最終實現基因突變、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系統已經被廣泛應用于基因編輯技術領域。 近年來，CRISPR/Cas9基因編輯系統在真核生物和原核生物中得到了廣泛的應用。在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，用一個載體表達cas9基因，同時由于革蘭氏陰性菌重組效率低，需要在這個載體上表達λ-RED重組酶；在另一個載體中表達sgRNA和用于同源重組的同源臂序列。兩個載體都轉入大腸桿菌中時，sgRNA介導Cas9蛋白切割基因組上特定序列，形成雙鏈斷裂，刺激同源重組的發生，從而實現基因編輯。 本項成果構建了適用于鹽單胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統。該系統由兩個載體組成：第一個載體表達Cas9基因，且不需要表達λ-RED重組酶，實際操作中不再需要誘導λ-RED重組酶的表達，簡化了步驟流程；第二個載體表達sgRNA，并含有用于同源重組的同源臂序列。從而實現了基因編輯。本項成果的技術優勢包括： （1）基因編輯時間由原有的20余天縮短到7-8天； （2）N個基因編輯時間由原有的N個月縮短到3+5N天； （3）無需表達λ-RED重組酶。                        圖1 鹽單胞菌TD01進行基因編輯的流程示意圖02.應用前景 本項成果可作為CRISPR/Cas9基因編輯系統的載體，廣泛應用于基因編輯領域。03.知識產權 本項成果已申請1項發明專利。04.團隊介紹 本項目為多團隊合作項目，其中一個團隊的負責人為清華大學教授，博士生導師，長江學者特聘教授，國家杰出青年基金獲得者。主要研究方向為合成生物學、微生物代謝工程、生物材料、工業生物技術。已發表國內外高水平學術論文數十篇，申請專利70余項。05.合作方式 投融資。06.聯系方式郵箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

一種家蠶滯育品種的低溫催青轉基因方法。用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性,使 特殊的催青條件下獲得的當代家蠶滯育品種蠶蛾交配，產下非滯育的下一代蠶卵，最后參照非滯育家蠶卵胚 胎顯微注射的轉基因方法進行轉基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的障礙并有效制作轉基因 蠶。該方法直接采用生產中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過 程，直接利用轉基因技術創造出各種性狀優良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節約大量的人 力和物力。一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉基因方法，利用在蠶卵胚胎發育至胚帶形成之前的一定時間內， 即產卵后2個半小時之前對家蠶滯育卵進行鹽酸的浸泡處理,隨后對處理解除滯育的蠶卵進行風臺顯微注射， 催青孵化獲得的GO代家蠶的飼養至化蛾，它們的自交或回交產生G1代，通過熒光標記篩選，從而有效制作 轉基因家蠶。該方法直接采用生產中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的 育種過程,直接利用轉基因技術創造出各種性狀優良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節約大 量的人力和物力。

1. 痛點問題 紅球菌是具有高抗逆性（耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產丙烯酰胺——其聚合產物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領域——迄今為止仍是工業生物技術領域最成功的案例之一。開發紅球菌基因編輯方法，一方面可以實現紅球菌細胞自身性能的按需調控（如敲除副產物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細化學品生產中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細胞為普適性宿主，高表達各種外源功能酶，從而實現重組紅球菌全細胞催化技術的普遍應用，尤其是解決手性醫藥中間體現有制備工藝中路線長、工藝復雜、原子經濟性差、環境污染嚴重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉化率低、非法重組嚴重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質粒介導的同源重組，但自殺質粒轉化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案 本技術核心成果是一種基于CRISPR（成簇規律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術通過紅色紅球菌特有啟動子及質粒元件，首先實現了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達及切割功能；其次成功規避了紅球菌的限制修飾系統，將紅色紅球菌基因轉化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統，不僅可以實現基因組上目標基因的敲除、替換和改造，也可實現多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細胞催化平臺技術開發及其在化學品綠色先進制造中的應用奠定了堅實基礎。 合作需求 開展合作開發、技術許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應用領域進行紅球菌全細胞催化法生產目標產品的企業合作，尤其是在上述不同領域具有生產和銷售優勢或經驗的企業。

選擇標記轉基因作物已成為近年來植物基因工程技術研究的重點之一，隨著轉基因作物產品的商品化，轉基因植物的生物安全性受到公眾越來越多的關注，尤其是目前抗生素標記基因在植物遺傳轉化過程中的廣泛應用，使人們對這些標記基因可能帶來的潛在危害性心存疑慮，抗性標記基因的存在嚴重地阻礙了轉基因植物的商品化進程和轉化技術本身的有效性。 本項目培育的無抗生素標記基因（可視化標記基因）在建立高效、安全、規模化的轉基因作物技術體系方面取得突破，以紫色幼芽作為可視篩選標記代替抗生素篩選標記，構建了新型轉化載體

本試驗通過石蠟切片技術對湘軍金魚性腺組織進行切片觀察，發現9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。 一、項目進展 創意計劃階段 二、負責人及成員 姓名 學院/所學專業 入學/畢業時間 洪迪珊 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2018/2022 陳雨薇 湖南師范大學生命科學學院/生物技術 2018/2022 劉雨欣 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2019/2023 馬彤彤 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2019/2023 黃志嫻 湖南師范大學生命科學學院/生物科學 2018/2022 三、指導教師 姓名 學院/所學專業 職務/職稱 研究方向 劉少軍 湖南師范大學生命科學學院/魚類遺傳育種 教授 魚類遺傳育種 王余德 湖南師范大學生命科學學院/魚類遺傳育種 講師 魚類遺傳育種 四、項目簡介 為探究湘軍金魚的胚胎發育過程、能育性、倍性以及Chordin A基因在湘軍金魚的雙尾性狀形成過程中的作用，本試驗通過石蠟切片技術對湘軍金魚性腺組織進行切片觀察，發現9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。試驗通過PHA體內誘導腎細胞制片法對湘軍金魚染色體數目進行統計，發現其染色體數目為100條。試驗通過PCR技術獲得了Chordin A基因全長，并對其進行生物信息學分析發現Chordin A基因全2634 bp，其中堿基A共618個，占比23.46%、堿基C共692個，占比26.27%、堿基G共756個，占比28.70%、堿基共568個，占比21.56%。堿基“G+C”占比 54.97%，堿基“A+T”占比45.03%。試驗對湘軍金魚不同組織進行Chordin A基因的熒光定量PCR試驗，發現Chordin A基因在尾鰭表達量最高。項目成員在進行科學探究的同時深挖湘軍金魚經濟價值，項目組成員多次赴雙峰縣、龍田鎮玉坪村等地進行實地調研,我們發現觀賞魚行業是朝陽行業，發展迅猛；與此同時湖南省休閑漁業來勢喜人，但是觀賞魚普遍魚病高發，變異物種破壞生態等問題。本項目借助湘軍金魚這一優質魚種，通過互聯網+農副產品的銷售模式，變單一銷售模式為多形式利益聯合，拉動當地的經濟增長。我們與村落達成了長期合作的關系。湘軍金魚作為優質觀賞魚備受消費者青睞。