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研發(fā)階段/n本發(fā)明公開了一種從高效表達(dá)的基因工程菌中提取重組黃曲霉尿酸氧化酶的方法。該菌是攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta(DE3)，該重組質(zhì)粒是含黃曲霉尿酸氧化酶uricase基因的質(zhì)粒pET-30c(+)。用該菌生產(chǎn)黃曲霉尿酸氧化酶的方法包括四個(gè)步驟：A、工程菌發(fā)酵，累積胞內(nèi)尿酸氧化酶；B、超聲波破胞，離心收集上清液（含可溶性尿酸氧化酶）；C、依次進(jìn)行離子交換層析、疏水層析及凝膠過濾層析，收集活性峰；D、將活性峰冷凍干燥，即得高純度的重組黃曲霉尿酸氧化酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)重組黃曲霉尿酸氧化

近日，東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院、江蘇省富碳材料器件工程研究中心張?jiān)〗淌趫F(tuán)隊(duì)（https://carbosensing.group）在Fe-N-C納米酶在催化抗壞血酸氧化反應(yīng)中的機(jī)制研究取得進(jìn)展，相關(guān)成果以“Insights into Iron Leaching from an Ascorbate-Oxidase-like Fe-N-C Nanozyme and Oxygen Reduction Selectivity”為題在化學(xué)領(lǐng)域國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Angew. Chem. Int. Ed.以VIP Paper形式在線發(fā)表。

本發(fā)明公開了一種海洋黑曲霉生產(chǎn)耐鹽纖維素酶的液體發(fā)酵方法。包括如下步驟:1)從東海近海10～20m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉;2)海洋黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基上,32～40℃下培養(yǎng)60～90小時(shí),得到斜面孢子,斜面孢子保藏于4℃;3)斜面孢子接種于PDA-1培養(yǎng)基,在32～40℃下培養(yǎng)60～90h,得到活化的孢子;4)活化的孢子接種于茄子瓶斜面,42℃培養(yǎng)74小時(shí),得到擴(kuò)培的茄子瓶斜面孢子;5)擴(kuò)培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌人工海水稀釋到108個(gè)孢子/ml,接種于液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基,發(fā)酵5～10天,得到纖維素酶。本發(fā)明具有產(chǎn)酶活高、酶穩(wěn)定、耐鹽性好等優(yōu)點(diǎn),生產(chǎn)的纖維素酶可以在較高鹽含量的條件下降解纖維素,為該水解物的后續(xù)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供一類具有酪氨酸酶抑制活性的化合物的制備方法，包括六種從桑葉中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚類化合物。通過將藥材經(jīng)乙醇水溶液加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用制備液相色譜繼續(xù)分離，收集溶液，溶液濃縮干燥后得到樣品并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。本發(fā)明還提供了從桑葉中分離上述多酚類化合物的方法。本發(fā)明提供的六種多酚類化合物具有較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，能夠有效預(yù)防和治療黑色素合成異常導(dǎo)致的人體色素沉著性疾病、黑色素瘤以及其它需要抑制酪氨酸酶活性的病癥，可用于制備治療此類疾病的藥物。

(R)-硫辛酸是一種能消除老化與致病的類似維他命的物質(zhì)，可以去除機(jī)體自由基，促進(jìn)機(jī)體利用葡萄糖合成維生素C，能有效去除黑色素，還可協(xié)助輔酶進(jìn)行有利于機(jī)體免疫力的生理代謝，是一種萬能抗氧化劑藥物，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療心臟病、糖尿病及老年癡呆癥。而近年來歐美國家開始將其應(yīng)用于食品、保健品及化妝品，應(yīng)用范圍的擴(kuò)展為其市場增長提供了廣闊的空間。目前 (R)-硫辛酸的生產(chǎn)主要是通過化學(xué)拆分法合成 (化學(xué)拆分法合成途徑) ，即先通過化學(xué)法合成混旋硫辛酸，再利用苯乙胺作為拆分劑對(duì)其進(jìn)行拆分，得到的右旋硫辛酸苯乙胺鹽，經(jīng)鹽酸脫鹽得到 (R)-硫辛酸粗品，精制后即可得到合格的 (R)-硫辛酸。但由于該法工藝復(fù)雜，需要多次結(jié)晶，成本高、理論得率僅為50%。 本技術(shù)利用酶法不對(duì)稱還原8-氯-6-羰基辛酸乙酯制備 (S)-8-氯-6-羥基辛酸乙酯，再結(jié)合化學(xué)法合成 (R)-硫辛酸的工藝路線 (化學(xué)-酶法合成途徑) ，可使 (R)-硫辛酸的合成步驟由化學(xué)-拆分法的9步縮減到化學(xué)-酶法的6步、產(chǎn)品收率提高40%、生產(chǎn)成本降低20%，而且也顯著地減少了原料消耗和廢物排放，是典型的環(huán)境友好的綠色合成工藝。合成的最終產(chǎn)品 (R)-硫辛酸的光學(xué)純度在99%以上，其產(chǎn)業(yè)化更具有經(jīng)濟(jì)效益、更符合綠色技術(shù)的要求。

氯吡格雷 (Clopidogrel) ，商品名波立維 (Plavix) ，是抑制血小板聚集的藥物。年銷售額超過百億美元，是目前世界上排名第二位的重磅炸彈級(jí)藥物。 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯是氯吡格雷原料藥合成的重要前體化合物，酶促鄰氯苯甲酰甲酸甲酯不對(duì)稱還原是制備 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯的重要方法，具有轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品光學(xué)純度好、環(huán)境污染小等顯著優(yōu)點(diǎn)。 本項(xiàng)目我們通過廣泛篩選，獲得一個(gè)高立體選擇性的羰基還原酶，將其與葡萄糖脫氫酶共克隆表達(dá)于大腸桿菌中，使用重組大腸桿菌整細(xì)胞在單水相體系中高效催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯的不對(duì)稱還原，使用廉價(jià)的葡萄糖作為輔底物，反應(yīng)體系中無需額外添加價(jià)格昂貴的輔酶，反應(yīng)體系簡便，原料成本低廉。底物濃度可高達(dá)600 g/L，完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物 (R)-鄰氯扁桃酸甲酯的得率高于90%，光學(xué)純度高于99.9%。具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。

阿托伐他汀，又名立普妥，能夠降低血漿膽固醇和脂蛋白水平，是目前世界銷售排名首位的重磅炸彈級(jí)藥物，年銷售額超過百億美元。 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯是阿伐他汀手性側(cè)鏈合成的重要前體化合物，酶促4-氯-乙酰乙酸乙酯不對(duì)稱還原是制備 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的重要方法，具有轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品光學(xué)純度好、環(huán)境污染小等顯著優(yōu)點(diǎn)。 本項(xiàng)目我們通過廣泛篩選，獲得一個(gè)高立體選擇性的羰基還原酶ScCR，該酶可以在有機(jī)/水兩相體系中高效催化4-氯-乙酰乙酸乙酯的不對(duì)稱還原，使用廉價(jià)的異丙醇作為輔底物，無需額外添加輔酶再生用酶，反應(yīng)體系簡單。使用含該酶的大腸桿菌整細(xì)胞作為催化劑，底物濃度可高達(dá)600 g/L，完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物 (S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的得率達(dá)96%，光學(xué)純度高于99%。具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。

該項(xiàng)目研制了一種能識(shí)別甲睪酮的特異性單克隆抗體, 它是由保藏號(hào)為CCTCC NO:C201493的雜交瘤細(xì)胞株MT9C10所分泌的。形成的檢測甲睪酮的酶聯(lián)免疫技術(shù)和試劑盒，與現(xiàn)有技術(shù)相比，制備的單克隆抗體可以識(shí)別甲睪酮，識(shí)別靈敏度高，特異性好，該項(xiàng)目ELISA技術(shù)和試劑盒檢測靈敏度、準(zhǔn)確度高，精密度好。 甲睪酮是一種人工合成的甾體類雄激素，具有環(huán)戊烷多氫菲的基本結(jié)構(gòu)，在獸醫(yī)臨床上，甲睪酮被大量應(yīng)用在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和骨骼肌的生長，通過抑制脂肪的增長，從而使肌肉變發(fā)達(dá)，并且能夠刺激動(dòng)物對(duì)食物的欲望，使動(dòng)物的日增重提高，同時(shí)大大提高了飼料的利用效率。 成果完成時(shí)間：2017年

1、成果來源、成果被評(píng)價(jià)及認(rèn)定（發(fā)明專利授權(quán)號(hào)）等情況 本項(xiàng)目來源于國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“大宗糧食綠色加工技術(shù)與 產(chǎn)品”中課題“玉米淀粉加工關(guān)鍵技術(shù)研究與示范（2012BAD34B07，479 萬元， 研究起止時(shí)間：2012.01-2014.12）”和國家自然科學(xué)基金“酶法選擇性合成單一 類型環(huán)糊精的控制策略研究（31101228，25 萬元，研究起止時(shí)間：2012.01- 2014.12）”，屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本項(xiàng)目累計(jì)申請(qǐng)發(fā)明專利 7 項(xiàng)（1 項(xiàng)獲授權(quán)），發(fā)表論文 11 篇（8 篇被 SCI 收錄），于 2015 年 7 月通過中國糧油學(xué) 會(huì)鑒定，獲國際先進(jìn)評(píng)價(jià)。 2、主要技術(shù)內(nèi)容、作用、對(duì)行業(yè)的意義，獲獎(jiǎng)情況 CGT 酶生產(chǎn)環(huán)糊精最不利的條件之一是產(chǎn)物特異性差，給產(chǎn)物的分離純化 帶來很大不便。同時(shí)，CGT 酶存在的另一大缺陷是其熱穩(wěn)定性較差，由于在環(huán)糊 精工業(yè)化生產(chǎn)中，底物淀粉首先要經(jīng)過高溫糊化、液化處理，然后降溫至適當(dāng)溫 度進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，若 CGT 酶能夠適應(yīng)更高的反應(yīng)溫度，勢必有助于提高反應(yīng)效率， 因此，有必要改善 CGT 酶的熱穩(wěn)定性，提高其催化效率，進(jìn)而有效降低環(huán)糊精生20 產(chǎn)成本。本項(xiàng)目主要是通過改善 CGT 酶產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性，提高該酶的使用 性能，將其應(yīng)用于環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)中，能顯著降低環(huán)糊精的生產(chǎn)成本，促進(jìn) 環(huán)糊精在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，隨著環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用 越來越廣闊，開發(fā)改善 CGT 酶使用性能的關(guān)鍵技術(shù)顯得尤為重要，具有很好的推 廣應(yīng)用前景。 3、成果的技術(shù)指標(biāo)、創(chuàng)新性與先進(jìn)性 本項(xiàng)目在長期從事淀粉生物轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)過程 中 CGT 酶的產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性較差問題，通過深入研究和不懈努力，逐步改 善了 CGT 酶的產(chǎn)物特異性和熱穩(wěn)定性，突破了關(guān)鍵技術(shù)，并實(shí)現(xiàn)了具有理想產(chǎn)物 特異性和熱穩(wěn)定性的β-CGT 酶突變體在酶法生產(chǎn)β-環(huán)糊精中的應(yīng)用。該酶使用 性能改善易操作，具有很好的應(yīng)用價(jià)值，技術(shù)位于國際領(lǐng)先水平。與國內(nèi)外同類 技術(shù)相比，具有以下創(chuàng)新： ①針對(duì) CGT 酶產(chǎn)物特異性較差的問題，確定了 CGT 酶的產(chǎn)物特異性與其一級(jí) 結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，獲得構(gòu)建具有理想產(chǎn)物特異性的 CGT 酶突變體的簡單可行方法， 為從本質(zhì)上改善 CGT 酶的產(chǎn)物特異性提供理論基礎(chǔ)； ②針對(duì) CGT 酶熱穩(wěn)定性較差的問題，采用定點(diǎn)突變技術(shù)闡明了重要氨基酸殘 基對(duì) CGT 酶熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的規(guī)律，獲得了構(gòu)建具有理想熱穩(wěn)定性的 CGT 酶突 變體的簡單可行方法，為從根本上改善 CGT 酶的熱穩(wěn)定性打下了基礎(chǔ)； ③ CGT 酶使用性能的改善方法簡單易行，所得到具有理想產(chǎn)物特異性和熱 穩(wěn)定性的酶突變體可直接應(yīng)用于β-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)，能提高β-環(huán)糊精的得 率，降低β-環(huán)糊精的生產(chǎn)成本。 

隨著首個(gè)RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發(fā)現(xiàn)，RNA表觀遺傳學(xué)/表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)開始興起并成為表觀遺傳學(xué)新的研究熱點(diǎn)。m6A作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結(jié)合蛋白發(fā)揮調(diào)控功能。已發(fā)現(xiàn)m6A具有調(diào)控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細(xì)胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過程的功能調(diào)控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m6A高通量測序技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。 現(xiàn)有m6A測序技術(shù)主要依賴于m6A抗體富集技術(shù)，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯(lián)用iCLIP或PAR-CLIP技術(shù)的高分辨率m6A測序技術(shù)miCLIP 或PA-m6A-seq。抗體存在對(duì)特定RNA序列或結(jié)構(gòu)的潛在非特異性結(jié)合，為了解決抗體方法的種種問題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發(fā)了兩類無需抗體的m6A測序技術(shù)，一類為利用對(duì)特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸內(nèi)切酶MazF輔助的測序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法只能檢測16~25%的m6A位點(diǎn)；另一種是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實(shí)現(xiàn)的m6A測序（DART-seq），但該方法依賴于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率且受限于體外樣品的使用。 賈桂芳課題組一直致力于開發(fā)和利用核酸化學(xué)生物學(xué)技術(shù)研究RNA化學(xué)修飾在動(dòng)植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學(xué)惰性的m6A轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)活性的中間態(tài)產(chǎn)物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發(fā)生亞胺1,2加成反應(yīng)，將不穩(wěn)定的hm6A轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的巰基加成產(chǎn)物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在mRNA上m6A的位置標(biāo)記生物素Biotin，最終可被鏈霉親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供后續(xù)高通量測序使用。