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本發(fā)明將裂解酶Bp7e氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分別進(jìn)行突變?yōu)楸彼岷凸劝彼幔?jīng)原核表達(dá)技術(shù)得到了突變體蛋白并經(jīng)Western-blot對其進(jìn)行了鑒定，命名為Bp7c突變體蛋白。對Bp7e和Bp7e突變體蛋白進(jìn)行了純化及濃度測定，通過體外裂解實驗及裂解譜檢測得知，純化的Bp7e和Bp7e突變體兩種蛋白具有廣譜的抑菌作用，對溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和多種血清型大腸桿菌均有裂解效果，且Bp7e突變體裂解效果整體優(yōu)于天然裂解酶Bp7e。

鑒定首個高階環(huán)加成酶，拓展了環(huán)加成酶的認(rèn)知 一、項目分類 重大科學(xué)前沿創(chuàng)新 二、成果簡介 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院梁勇教授，生命科學(xué)學(xué)院譚仁祥教授和戈惠明教授的科研團(tuán)隊，發(fā)現(xiàn)了抗幽門螺旋桿菌的潛在藥物-漢城霉素并對其生物合成途徑進(jìn)行深入研究。通過多菌株基因組序列比對，對漢城霉素類生物合成基因簇進(jìn)行了鑒定，利用微生物學(xué)，分子生物學(xué)、底物化學(xué)衍生化、體外酶促反應(yīng)等手段從該基因簇中鑒定出一個新穎、可催化高階環(huán)加成反應(yīng)的酶。團(tuán)隊基于蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)，量子化學(xué)計算和蛋白質(zhì)定點突變技術(shù)，對該酶促動力學(xué)過程進(jìn)行了深入解析，最終確定該酶通過“雙過渡態(tài)”來同時催化產(chǎn)生6+4和4+2環(huán)加成產(chǎn)物。該特殊高階環(huán)加成酶的發(fā)現(xiàn)，解答了“自然界中是否存在酶催化的高階環(huán)加成反應(yīng)”，這一持續(xù)五十余年的謎題。這類酶的發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步拓展人們對周環(huán)反應(yīng)酶的認(rèn)識，啟發(fā)科學(xué)家們將來利用和改造周環(huán)反應(yīng)酶來實現(xiàn)有價值的分子轉(zhuǎn)化。 成果于2019年4月以Letter形式發(fā)表于Nature。F1000評述該研究“鑒定首個高階環(huán)加成酶，拓展了環(huán)加成酶的認(rèn)知”，諾貝獎得主霍夫曼評述“這是在酶促反應(yīng)中直接觀察到的[6+4]環(huán)加成產(chǎn)物的首個例子……，該研究對酶促高階環(huán)加成研究具有深遠(yuǎn)影響”。

磷脂酶D（PLD,EC 3.1.4.4）是一類廣泛存在于各種生物體的酶，具有水解作用和磷?；D(zhuǎn)移作用（見圖1）。作為一種酶制劑，PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；钚杂葹橹匾?，被用于制備具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰膽堿（PC）為底物，PLD酶法制備磷脂酰絲氨酸（PS），受到廣泛關(guān)注。PS作為腦健康營養(yǎng)補充劑，相繼被美國FDA、日本HBM和中國國家衛(wèi)生計生委所認(rèn)證，列為新資源食品。相較于提取自牛腦和植物的PS，生物酶法制備的PS，避免了食品安全和植物源含量低的問題。進(jìn)一步，一些新的結(jié)構(gòu)和功能磷脂，通過PLD轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)被合成出來，例如，磷脂酰鯊肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂類似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰絲氨醇，它們中一些具有抗癌和抗氧化活性。 直到現(xiàn)在，受限于磷脂酶D來源不足和價格高（鏈霉菌屬PLD，≥150 units/mg，6516.9¥/1000 U，Sigma公司），其工業(yè)上的廣泛應(yīng)用受到限制。例如，文獻(xiàn)報道的PLD最高產(chǎn)量在104-105U·L-1，而制備轉(zhuǎn)化得到每公斤PS，需要2.6×106U的PLD。這一障礙的主要原因是高水平表達(dá)的PLD對宿主的嚴(yán)重細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 歷經(jīng)5年時間，從上游到下游整體設(shè)計，我們解決了毒性蛋白（磷脂酶D，PLD）異源表達(dá)難的問題（質(zhì)粒不穩(wěn)定、蛋白合成時間短、細(xì)胞生長抑制和裂解），PLD生產(chǎn)達(dá)到目前世界最高水平106U·L-1(748 mg·L-1)（提高20倍）；同時發(fā)展一種簡單有效提取重組磷脂酶D的方法（無需破碎、無需添加溶菌酶和有機溶劑、室溫進(jìn)行），PLD生產(chǎn)成本有望降低20倍以上。按照實驗室規(guī)模的一臺5 L發(fā)酵罐，年產(chǎn)量可以提供3.5×108U的磷脂酶D，滿足100 kg的PS轉(zhuǎn)化需求計算（不計算PLD重復(fù)利用率），擴大反應(yīng)器體積至100-1000 L，PLD產(chǎn)量可滿足制備2-20噸PS的需求。

本發(fā)明提供一種巴斯德畢赤酵母、產(chǎn)生的耐高溫蛋白酶及應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域；本發(fā)明通過選育一種可產(chǎn)生耐高溫酶的巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)AN?PK?9K?GS115，然后將其進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)酵液中提取耐高溫蛋白酶，將其用于羽毛粉的水解，可以有效水解羽毛粉，將其中蛋白質(zhì)組分高效降解為小肽成分或者氨基酸成分，從而提高蛋白質(zhì)的消化率，增加采食量，提高動物健康水平。 （注：本項目發(fā)布于2019年）

本發(fā)明提供了一種固定化磷脂酶A1在制備磷脂DHA中的應(yīng)用，具體過程為，六水硝酸鈷和2?甲基咪唑分別溶于無水甲醇得到六水硝酸鈷溶液和2?甲基咪唑溶液，將2?甲基咪唑溶液滴加至六水硝酸鈷溶液中，攪拌反應(yīng)、靜置、干燥，得到ZIF?67納米材料，將ZIF?67納米材料于磷酸鈉緩沖液中混懸，加入磷脂酶A1溶液，調(diào)節(jié)pH，置于搖床孵育，離心、干燥，獲得ZIF?67納米材料固定化磷脂酶A1；將游離脂肪酸和大豆卵磷脂組成的底物和固定化磷脂酶A1在有機反應(yīng)體系中進(jìn)行催化反應(yīng)，分離純化獲得磷脂DHA。固定化磷脂酶A1，穩(wěn)定性好，催化制備磷脂DHA，DHA摻入率高達(dá)51.04%。

低分子量肝素(LMWH)是臨床上最主要的天然抗凝劑，目前主要是通過動物來源的肝素進(jìn)行酶降解制得。歐洲藥典要求 LMWH 的分子量為 6000~8000，質(zhì)量控制是生產(chǎn) LMWH 的重要環(huán)節(jié)。而肝素酶的活性和利用率直接影響 LMWH 生產(chǎn)成本和產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)。 本項目組利用融合肝素酶 I (Hep I)與甲殼素之間的親和作用，實現(xiàn)酶的循環(huán)利用，同時融合酶活性和穩(wěn)定性提高。利用綠色溶劑體系制備形態(tài)完好、尺寸均一的甲殼素微球。用固定化酶制備的 LMWH 產(chǎn)品達(dá)到歐洲藥典要求，實現(xiàn)了分子量可控，生產(chǎn)過程可實時監(jiān)測。該項目將對 LMWH 產(chǎn)業(yè)的綠色和經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。目前已發(fā)表 SCI 論文 2 篇，并與相關(guān)企業(yè)開展了合作。 

角蛋白酶是一種特異性蛋白酶類，可降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜、硬質(zhì)難溶的角蛋白，具有多種優(yōu)良的催化特性，在生物加工、綠色制藥、廢棄生物質(zhì)處理、生物制革、生態(tài)紡織、洗滌劑等實際應(yīng)用中備受關(guān)注，被認(rèn)為是有著巨大應(yīng)用潛力和市場前景的新一代蛋白酶類。 本項目從角蛋白酶基因挖掘、高效表達(dá)、性能改造及其應(yīng)用研究等方面開展了一系列工作。課題組目前建立了角蛋白酶資源庫，是我國擁有角蛋白酶基因資源產(chǎn)權(quán)最多和最具多樣性來源的單位；實現(xiàn)了角蛋白酶基因在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌等外源宿主中的克隆及高效表達(dá)；在 5L 罐上發(fā)酵酶活最高可達(dá)10000 U/mL 以上，是目前文獻(xiàn)報道的重組角蛋白酶表達(dá)最高水平；項目已完成了 1M3 規(guī)模中試試驗，成本降低 30%以上。在應(yīng)用方面，本項目成功將角蛋白酶用于生物法制備納米銀粒子 AgNPs，與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，酶法合成的納米銀具有更好的抑菌活性。另外，項目組已首次開發(fā)出無膠原活力的高特異性角蛋白酶，具有高角蛋白活力，不會對皮革膠原造成破壞，能保護(hù)膠原結(jié)構(gòu)完整性，可開發(fā)出不傷及皮膚真皮的洗滌劑產(chǎn)品、藥品及化妝品，在生物制革領(lǐng)域也具有極大應(yīng)用價值，可緩解制革工業(yè)中的爛皮現(xiàn)象；同時本研究所開發(fā)的角蛋白酶在活性多肽制備中也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

本課題組在非均相氧化羰基化法一步碳酸二苯酯的進(jìn)展 本課題組2000年就提出非均相一步合成DPC且在此方面作了大量的工作首先對催化劑載體的制備方法進(jìn)行了研究，現(xiàn)在其收率可達(dá)到26％、選擇性能達(dá)到99％。發(fā)表有關(guān)論文13篇，其中SCI收錄5篇、EI收錄兩篇，發(fā)明專利1項。申報并獲得授權(quán)的與之相關(guān)的項目有：國家自然基金2項，省項目2項，武漢市科委重大攻關(guān)項目1項。所以本課題組的實驗室小試成果在國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中尚處于先進(jìn)水平。

超細(xì)高純金紅石型鈦白粉是利用其隨角異色性，在轎車閃光面漆中應(yīng)用獲得色彩豐富的涂層，并使漆面經(jīng)久耐用，長期保持鮮艷如新。隨著高速公路和轎車工業(yè)的快速發(fā)展，高檔面漆市場供不應(yīng)求，主要原因是金紅石型鈦白粉生產(chǎn)廠家太少，主要是依賴進(jìn)口，使成本大幅增加。在國外發(fā)達(dá)國家中，研究和生產(chǎn)這類產(chǎn)品的廠家較多，并研究開發(fā)成功了較多的生產(chǎn)方法，如液相中和法，四氯化鈦氣相水解法，烷氧基鈦氣相水解法，膠體化學(xué)法等。它們各有優(yōu)缺點，其中，第一、四種方法原料來源較為方便，且價格較低，因而采用更普遍一些。 以鈦鐵礦和濃硫酸為原料先制得硫酸氧鈦，加入純堿溶液，生成氫氧化鈦沉淀，再加入鹽以生成水合二氧化鈦凝膠，用陰離子表面活性劑使之成為凝膠，再采用有機溶劑進(jìn)行擠水處理，得到有機凝膠，再除去有機溶劑，在低于陰離子表面活性劑的分解溫度下進(jìn)行熱處理，即可得到超細(xì)高純金紅石型鈦白粉產(chǎn)品。