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該項(xiàng)目 成功 構(gòu)建 了 一株高 產(chǎn)堿 性果 膠 酶的畢 赤酵 母工 程 菌 (Pichia pastoris GS115),通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制，在 3L 罐中酶活達(dá)到 890U/mL。 在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了堿性果膠酶的中試及其工業(yè)化研究，在 10 噸發(fā)酵罐中產(chǎn)酶達(dá)到 1305U/mL.采用該重組堿性果膠酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)的強(qiáng)堿高溫工藝，廢水 COD 顯著降低，可生化性較大提高。處理體系 pH 值為 9.4，代于堿精練水平；酶處理溫度低于堿處理，這些結(jié)果對(duì)棉織物前處理的清潔生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 

本發(fā)明達(dá)到的技術(shù)效果為工程化釀酒酵母菌可實(shí)現(xiàn)無(wú)需添加異源前體物或底物僅通過(guò)培養(yǎng)微生物即可從頭合成高效人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1等三種齊墩果烷型稀有人參皂苷以及金盞花苷E。 一、項(xiàng)目分類(lèi) 關(guān)鍵核心技術(shù)突破 二、技術(shù)分析 人參皂苷Ro 是人參的主要活性成分之一，具有多種藥理、生理活性,在人參中含量較低（約0.4%），無(wú)法滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，而利用微生物從頭合成人參皂苷Ro則可以有效解決該問(wèn)題，顛覆傳統(tǒng)的獲取方式，然而合成途徑未知，目前尚未有利用微生物從頭合成的報(bào)道。 本發(fā)明技術(shù)方案：1.通過(guò)生物信息學(xué)分析，對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中的多種植物基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比對(duì)，初步篩選候選基因，再結(jié)合前期經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析、同源建模、分子對(duì)接、保守序列分析等手段，確定最終的候選基因；2.通過(guò)酶工程等手段，對(duì)候選基因進(jìn)行重組表達(dá)、體外酶活驗(yàn)證、底物譜驗(yàn)證等，挑選最合適的酶；3.通過(guò)合成生物學(xué)、代謝工程、分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)手段，對(duì)相關(guān)酶進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建、底盤(pán)宿主代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、異源途徑整合，最終成功構(gòu)建人參皂苷Ro微生物細(xì)胞工廠(chǎng)。 本發(fā)明解決了人參皂苷Ro天然代謝途徑未知、異源途徑與底盤(pán)宿主適配性、已報(bào)道相關(guān)酶活性低等關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明達(dá)到的技術(shù)效果為工程化釀酒酵母菌可實(shí)現(xiàn)無(wú)需添加異源前體物或底物僅通過(guò)培養(yǎng)微生物即可從頭合成高效人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1等三種齊墩果烷型稀有人參皂苷以及金盞花苷E。 本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)包括：1.通過(guò)基因挖掘手段獲得的關(guān)鍵酶性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于已報(bào)道的酶；2.通過(guò)基因挖掘手段獲得的多個(gè)關(guān)鍵酶，實(shí)現(xiàn)了人參皂苷Ro的合成途徑構(gòu)建；3.首次實(shí)現(xiàn)了利用微生物從頭合成人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1等三種齊墩果烷型稀有人參皂苷以及金盞花苷E。 齊墩果烷型稀有人參皂苷，由于其豐富且具備一定特殊性的藥理、生理活性，可作為現(xiàn)有人參皂苷市場(chǎng)的強(qiáng)力補(bǔ)充，應(yīng)用前景廣闊。而其天然含量極低，利用微生物對(duì)其進(jìn)行從頭合成可大大降低生產(chǎn)成本與產(chǎn)物分離純化難度，減少有機(jī)試劑用量，不依賴(lài)植物種植，周期更短，符合國(guó)家綠了環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的硬性要求，微生物綠色制造是當(dāng)前的政策導(dǎo)向也是發(fā)展的必然趨勢(shì)。

該技術(shù)利用不同食用菌子實(shí)體或加工副產(chǎn)物，制作不同功效的食用菌系列 凍干方便菌湯，適用于食品加工企業(yè)、凍干食品加工企業(yè)、果蔬加工企業(yè)。解 決了生鮮果、菜、菌加工副產(chǎn)物綜合高效利用問(wèn)題；將生鮮果、菜、菌的營(yíng)養(yǎng) 與保健功效與糕點(diǎn)、面點(diǎn)相結(jié)合，改善和提高了普通糕點(diǎn)及面食制品的營(yíng)養(yǎng)與 功能；增加了糕點(diǎn)及面食制品的花色品種，以滿(mǎn)足消費(fèi)者的多樣化需求。該技 術(shù)可直接對(duì)生鮮果、菜、菌加工副產(chǎn)物進(jìn)行濕法打漿利用，省去了脫水干燥與 粉碎工序，簡(jiǎn)化了工藝流程，降低了加工能耗。通過(guò)打發(fā)順序的調(diào)整和有關(guān)配 料的應(yīng)用，提高了制品的性能，保護(hù)了原料中的營(yíng)養(yǎng)與功效成分。

本實(shí)用新型涉及一種乳酸菌復(fù)合菌劑的制備裝置，包括外箱體，外箱體頂部設(shè)置有蒸汽接口，外箱體內(nèi)上部設(shè)置有上端開(kāi)口的原料箱，原料箱通過(guò)管道連接有位于其下方的混合箱，混合箱兩端均通過(guò)轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動(dòng)固定在固定板上，混合箱底部設(shè)置有凸輪，凸輪連接有位于外箱體外的驅(qū)動(dòng)裝置，混合箱通過(guò)管道連接有菌種箱和培養(yǎng)箱，菌種箱通過(guò)管道與培養(yǎng)箱相連，菌種箱連接有伸出外箱體外的接種管，培養(yǎng)箱底部設(shè)置有加熱裝置，加熱裝置與控制器相連；本實(shí)用新型通過(guò)將原料箱、混合箱、菌種箱和培養(yǎng)箱均設(shè)置在外箱體內(nèi)，方便進(jìn)行蒸汽滅菌消毒，保證培養(yǎng)過(guò)程中的無(wú)菌無(wú)氧環(huán)境，凸輪驅(qū)動(dòng)混合箱搖晃，避免傳統(tǒng)攪拌葉污染培養(yǎng)液的隱患。

本項(xiàng)目涉及功能性醋酸菌/乳酸菌及其發(fā)酵調(diào)控技術(shù)，可用于果蔬飲品、酵素、新型調(diào)味品的發(fā)酵制造。水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品由于其保質(zhì)期短，運(yùn)輸成本高，較適宜于在原產(chǎn)地或產(chǎn)地附近進(jìn)行深加工，以延長(zhǎng)保質(zhì)期及產(chǎn)品附加值。發(fā)酵類(lèi)果蔬飲品由于經(jīng)過(guò)微生物處理，在口味、質(zhì)地以及營(yíng)養(yǎng)成分等方面均得到了顯著改善，其中果蔬類(lèi)益生菌類(lèi)發(fā)酵飲品，更是得到關(guān)注健康的消費(fèi)人群的青睞。然而目前市場(chǎng)中的發(fā)酵果蔬汁類(lèi)產(chǎn)品，魚(yú)龍混雜，很多產(chǎn)品存在發(fā)酵程度不高；高度依賴(lài)后調(diào)配；微生物混亂及發(fā)酵過(guò)程控制不科學(xué)；食品安全性不能得到保障等問(wèn)題。 針對(duì)這一類(lèi)型的產(chǎn)品，本項(xiàng)目從發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝、功能成分分析以及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化等方面系統(tǒng)的進(jìn)行了研發(fā)。 1）豐富的菌種：本課題組擁有近百株背景明確、安全可靠、發(fā)酵性能優(yōu)良 的微生物，形成了完備的釀造用菌種庫(kù)，包括乳酸菌、醋酸菌、酵母菌、米曲霉等。可以針對(duì)不同的發(fā)酵原料以及最終產(chǎn)品口感及質(zhì)構(gòu)的要求，選擇一種益生菌或復(fù)合發(fā)酵菌種，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的定制需求。 2）科學(xué)工藝：通過(guò)科學(xué)的發(fā)酵工藝及過(guò)程控制，實(shí)現(xiàn)了乳酸菌等微生物的高密度培養(yǎng)，活菌數(shù)可達(dá) 100 億/ml。大幅降低生產(chǎn)成本和周期，混菌發(fā)酵可由幾個(gè)月縮短至 10 天內(nèi)，乳酸菌發(fā)酵縮短至 24 小時(shí)內(nèi)。實(shí)現(xiàn)高效的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，總酸可以達(dá)到 6%，提高產(chǎn)品品質(zhì)及生產(chǎn)穩(wěn)定性。 3）成分分析：建立了完備的發(fā)酵產(chǎn)品成分分析技術(shù)平臺(tái)。針對(duì)與產(chǎn)品風(fēng)味、以及腸道調(diào)節(jié)、增強(qiáng)免疫等健康功能緊密相關(guān)的有機(jī)酸、短鏈脂肪酸、多酚、多肽等功能成分進(jìn)行精確定量分析以及健康功能評(píng)價(jià)。 4）產(chǎn)品風(fēng)味: 本課題組研發(fā)的果蔬發(fā)酵產(chǎn)品口味濃郁、發(fā)酵特色明顯，無(wú)不良異味。避免了發(fā)酵后的過(guò)度調(diào)配及添加劑的使用，即可達(dá)到較優(yōu)的感官要求。符合健康、綠色的現(xiàn)代加工食品的需求。 

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中許多病害發(fā)生、發(fā)展嚴(yán)重，目前在生產(chǎn)中仍以化學(xué)防治為主，由于田間化學(xué)用藥次數(shù)的提高，病菌已產(chǎn)生明顯的抗藥性。如番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的，是番茄生產(chǎn)中的主要病害，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量及品質(zhì)。由于缺乏抗灰霉病的抗原材料，通過(guò)常規(guī)方法很難育成番茄灰霉病的抗性品種。傳統(tǒng)的化學(xué)防治不僅高殘留、高污染，且對(duì)葉圍有益微生物區(qū)系造成破壞，自然抗病能力進(jìn)一步減弱。隨著人們生活水平的提高，對(duì)番茄等果蔬產(chǎn)品的品質(zhì)要求越來(lái)越高，綠色和有機(jī)食品逐漸成為消費(fèi)市場(chǎng)的主流，市場(chǎng)潛力巨大。在食品安全、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的時(shí)代潮流下，研發(fā)新型生物農(nóng)藥逐步取代化學(xué)農(nóng)藥已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要目標(biāo)，也是經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的必然趨勢(shì)。 利用生防微生物及其次生代謝產(chǎn)物是生物防治的重要手段，我國(guó)和世界上許多國(guó)家已有商品化微生物農(nóng)藥產(chǎn)品。目前對(duì)于番茄灰霉病的微生物防治研究多數(shù)處于實(shí)驗(yàn)室和溫室階段，田間應(yīng)用的極少，多數(shù)菌劑在田間應(yīng)用過(guò)程中防效不穩(wěn)，這是制約微生物菌劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。此外，多數(shù)研究只是針對(duì)某一種病害，具有廣譜抗性的菌株很少。本實(shí)驗(yàn)室在土壤中分離出一株新的粉紅粘帚菌（WY-1），初步研究表明，該菌對(duì)番茄灰霉病、葉霉病、枯萎病、黃萎病和綿疫病等病原菌均有抑制作用（已獲專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)ZL2009 1 0072862.4）該菌株是可通過(guò)多種機(jī)制共同作用抑制數(shù)種植物病原菌的生防菌，能有效的防治番茄、辣椒等多種作物的灰霉病、葉霉病、枯萎病、黃萎病和綿疫病等，同時(shí)具有較好的促生作用，具有一菌多效的特點(diǎn)。其作用機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、溶菌、拮抗和誘導(dǎo)抗性等。由于該生物制劑是一種廣譜抗性的生防菌劑，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的社會(huì)意義。這種以防治番茄灰霉病為主的廣譜性生防菌劑，可以有效的控制保護(hù)地生產(chǎn)病害的發(fā)生，在滿(mǎn)足菜籃子需求的基礎(chǔ)上，更保證了有機(jī)蔬菜的安全生產(chǎn)。

葡萄糖二酸是一種重要的化合物，在醫(yī)療和工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。目前生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法主要以化學(xué)法-葡萄糖化學(xué)氧化法為主，但該方法具有選擇性低、成本高、得率低、要高溫及產(chǎn)生大量氧化反應(yīng)副產(chǎn)物不利于后續(xù)葡萄糖二酸的分離等局限性。目前生物法合成葡萄糖二酸主要是在大腸桿菌中進(jìn)行的，但在大腸桿菌中異源合成葡萄糖二酸被許多因素限制。釀酒酵母因具有耐酸能力強(qiáng)、耐低溫、可低 pH 發(fā)酵、沒(méi)有噬菌體感染、適合大規(guī)模發(fā)酵、易分離和高抗逆性等特點(diǎn)，已被廣泛用于產(chǎn)有機(jī)酸的研究，因此釀酒酵母比大腸桿菌更適合葡萄糖二酸的生產(chǎn)并具有更高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。利用釀酒酵母合成葡糖二酸具有很好的應(yīng)用前景。 創(chuàng)新要點(diǎn) 1) 以釀酒酵母 BY4741 為出發(fā)菌株，將擬南芥的肌醇加氧酶 MIOX4 和丁香假單胞菌的 UDH 基因在 delta 重復(fù)序位點(diǎn)高效表達(dá)，敲除轉(zhuǎn)錄抑制因子OPI1 獲得工程菌 Bga-3，該菌株在分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下能夠產(chǎn) 6 g/L 的葡萄糖二酸，為目前報(bào)道的最高值； 2) 通過(guò)提高工程菌的轉(zhuǎn)運(yùn)胞外肌醇的能力和工程菌自身合成肌醇的能力，解決提高葡萄糖二酸產(chǎn)量的關(guān)鍵問(wèn)題； 3) 進(jìn)一步協(xié)調(diào)肌醇用于細(xì)胞自身代謝活動(dòng)和葡萄糖二酸合成之間的分配關(guān)系，并通過(guò)提高葡萄糖二酸合成途徑效率和發(fā)酵優(yōu)化，提高肌醇利用率和葡萄糖二酸合成的產(chǎn)量。 

機(jī)體內(nèi)無(wú)機(jī)元素的代謝紊亂是糖尿病發(fā)病原因之一，因?yàn)橐葝u素抵抗而形成大量的Ⅱ型糖尿病。研究證明，鉻和釩元素可以提高靶組織對(duì)胰島素的敏感性因此補(bǔ)鉻補(bǔ)釩是提高胰島素利用率，降低胰島素抵抗的有效途徑之一，同時(shí)可以緩解由于胰島素抵抗而引起的眾多糖尿病并發(fā)癥。以酵母菌為載體提供的有機(jī)鉻和有機(jī)釩，有利于人和動(dòng)物體的吸收利用，減少應(yīng)激性，而且在加工和儲(chǔ)存中更為穩(wěn)定。因此是安全高效的鉻釩元素補(bǔ)充形式。本項(xiàng)目提供鉻釩酵母的生產(chǎn)和鉻釩酵母相關(guān)食品飲料的制造技術(shù)。

可以量產(chǎn)/n針對(duì)當(dāng)前工業(yè)發(fā)展對(duì)脂肪酶的大量需求與脂肪酶實(shí)際表達(dá)水平較低的技術(shù)瓶頸，突破了脂肪酶超高效表達(dá)技術(shù)關(guān)鍵，建立了真菌脂肪酶高效表達(dá)技術(shù)平臺(tái)，構(gòu)建的解酯耶氏酵母脂肪酶Lip2基因工程菌10L發(fā)酵，酶活力可達(dá)6,5000 U/ml以上，比國(guó)際報(bào)道的最高值提高4倍以上，具有極強(qiáng)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。產(chǎn)品可用于油脂水解、轉(zhuǎn)酯、食品加工、烘焙、生物柴油制備、飼料添加劑、再生紙脫墨等廣泛用途。建設(shè)其發(fā)酵生產(chǎn)線(xiàn)預(yù)計(jì)需要800-1000萬(wàn)元，經(jīng)濟(jì)效益可觀。解酯耶氏酵母脂肪酶Lip2可用于油脂水解、轉(zhuǎn)酯、食品加工、烘

成果與項(xiàng)目的背景及主要用途： 蚯蚓又稱(chēng)地龍，是以土壤中的動(dòng)植物碎屑為食，經(jīng)常在地下鉆洞，把土壤翻 得疏松，使水分和肥料易于進(jìn)入土壤而提高土壤的肥力，有利于植物的生長(zhǎng)；據(jù) 測(cè)定，蚯蚓的蛋白質(zhì)含量約占干重的 53.5%-65.1%，脂肪含量約為 4.4%-17.38%， 碳水化合物約為 11%-17.4%，灰分 7.8%-23%。蚯蚓體內(nèi)還含有豐富的維生素 D （約占鮮體重的 0.04%-0.073%），以及鈣和磷（約占鮮體重的 0.24%-0.188%） 等礦物質(zhì)元素，所以蚯蚓可以作為家禽的飼料，是雞鴨喜好的“肉類(lèi)”食物；蚯蚓 體內(nèi)含有地龍素，地龍解毒素，黃嘌呤，抗組織胺和維生素 B 等多種藥用成分， 可作為很好的藥用材料；此外，蚯蚓還在淡水釣魚(yú)中適應(yīng)面廣，各種水域，魚(yú)類(lèi)， 212天津大學(xué)科技成果選編 氣候都較適宜的釣餌。目前養(yǎng)殖蚯蚓，一般以牛糞，豬糞等動(dòng)物糞便及稻草，沼 氣和生活垃圾等為飼料，但這些資源或者數(shù)量少或者難以收集。 近年來(lái)，隨著食用菌需求量的不斷增加，以農(nóng)作物秸稈和棉籽殼為培養(yǎng)基料 栽培生產(chǎn)食用菌技術(shù)發(fā)展迅速，并逐步形成規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化。而栽培各種食用菌 類(lèi)后剩下的底料-菌糠，數(shù)量也大增。據(jù)測(cè)定，收菌后的菌糠，粗纖維降解 50%， 木質(zhì)素降解 20%，而粗蛋白含量由原來(lái)的 2%提高到 6%-7%，脂肪含量增加 1-5 倍，而且易于粉碎，氣味芳香，適口性好。此外，菌糠中還含有豐富的氨基酸， 多糖及鐵鈣鋅鎂等微量元素，以及一些代謝產(chǎn)物如微涼酚性物，少量生物堿，黃 酮，還含有肌酸多肽植物甾醇及三萜皂苷等化學(xué)物質(zhì)。丟棄不僅浪費(fèi)資源，而且 會(huì)造成環(huán)境污染。因此，菌糠是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中很好的肥料原料，應(yīng)充分加以利用。 技術(shù)原理與工藝流程簡(jiǎn)介： 1 對(duì)菌糠的前處理：將食用菌的廢棄培養(yǎng)基菌糠粉碎，噴水?dāng)嚢瑁蛊涑浞?濕潤(rùn)，且均勻，裝入發(fā)酵罐內(nèi)。 2 加入 40-50℃水使菌糠的含水量在 50%-60%，優(yōu)選 55%，再用 80-85℃的 熱空氣滅菌 16-20 小時(shí)，優(yōu)選 18 小時(shí)，降溫至 30-40℃。 3 加入至少含有 1*108 個(gè)菌/克的菌粉，所述菌粉加入質(zhì)量為菌糠干重的 1.0%-2.5%，所述菌粉為乳酸菌、芽孢桿菌和粉狀畢赤酵母菌株至少一種。通入 30-40℃的空氣，通空氣量為 0.2-0.3L/min*kg 菌糠干重，通空氣 24-36 小時(shí)，然 后密閉發(fā)酵 10-15 天，得到發(fā)酵產(chǎn)物，將所述發(fā)酵產(chǎn)物移除發(fā)酵罐，晾曬 1-2 天。 4 用草木灰和石灰粉調(diào)節(jié) pH 為 6.0-7.0，既制成一種菌糠混合發(fā)酵制備的蚯 蚓餌料。 5 采取室內(nèi)養(yǎng)殖蚯蚓，將制備的蚯蚓餌料均勻鋪在 100*30*30cm 的木盆里， 厚度 10cm，鋪好后，撒上適量的水，餌料的濕度保持在 50%-70%之間。將蚯蚓 均勻撒上，每平方米投放蚯蚓 500g，溫度保持在 15-25℃。蚯蚓投放一天，觀察 無(wú)異常反應(yīng)，19 天可擴(kuò)群一倍。 應(yīng)用前景分析及效益預(yù)測(cè)： 213天津大學(xué)科技成果選編 本項(xiàng)目克服了現(xiàn)有蚯蚓養(yǎng)殖培養(yǎng)料資源缺乏和菌糠污染環(huán)境的不足，采用菌 糠混合發(fā)酵制備蚯蚓餌料為菌糠的綜合利用及生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品（蚯蚓）提供了 一條有效解決途徑。 技術(shù)水平及專(zhuān)利與獲獎(jiǎng)情況： 已獲得相關(guān)授權(quán)專(zhuān)利 應(yīng)用領(lǐng)域：蚯蚓養(yǎng)殖企業(yè)，食用菌生產(chǎn)企業(yè)