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本發(fā)明涉及一種融合型抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。通過枯草芽孢桿菌 WB600 所攜帶質(zhì)粒 pHYSGA 獲得分泌的融合型抗菌肽 GA，該融合型抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有一定抑菌活性，作為添加劑加入飼料中，飼喂雞雛后表明該融合肽可以提高雞雛體重增長率、提高雞雛的免疫指標(biāo)，可以成為禽畜、水產(chǎn)飼料中抗生素的優(yōu)秀替代品。

抗菌肽（antibacterial peptides or antimicrobial peptides）是生物體中存在的具有廣譜抗菌活性的內(nèi)源性肽類物質(zhì)，具有抗細(xì)菌、真菌和病毒的活性，也具有抗腫瘤的作用。分子量在2000～7000左右，由20～60個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)，在食品和藥品方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本項(xiàng)目采用有機(jī)溶劑提取、高速離心分離純化、真空低溫等高技術(shù)提取分離純化中國林蛙蛙皮中的活性生物肽生產(chǎn)天然生物抗菌劑。

項(xiàng)目成果/簡介: 抗菌肽( Antibacterial peptides) 是由動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)特定基因編碼，經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類對細(xì)菌、真菌及病毒等微生物具有殺傷作用的多肽?？咕牟煌诳股氐淖饔脵C(jī)制?？咕膶?xì)菌、真菌、病毒和腫瘤等均有作用，尤其對耐藥性細(xì)菌有殺滅作用，具有廣譜性。 本項(xiàng)目主要涉及4種不同來源抗菌肽工程菌株以及生產(chǎn)工藝。具體為：美洲擬鰈抗菌肽Pleurocidin、果蠅抗菌肽Metchnikowin、假黑盤菌抗菌肽-菌絲霉素Plectasin以及梭魚娃2-RPLX等4種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工程菌株及菌株高效發(fā)酵生產(chǎn)工藝。 技術(shù)指標(biāo)（創(chuàng)新要點(diǎn)等）： 1. 抗菌肽工程菌株的構(gòu)建 2. 抗菌肽的分離純化以及活性鑒定； 3. 抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工藝參數(shù)及流程。 抗菌肽的生物活性主要有抑制或殺滅細(xì)菌作用、抗真菌作用、抗病毒活性、抗寄生蟲作用、免疫調(diào)節(jié)作用以及抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞作用。目前主要應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于作為抗生物替代品用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、飼料工業(yè)、食品工業(yè)。知識(shí)產(chǎn)權(quán)類型:生物醫(yī)藥新品種技術(shù)先進(jìn)程度:達(dá)到國內(nèi)先進(jìn)水平成果獲得方式:獨(dú)立研究獲得政府支持情況:無

抗菌肽( Antibacterial peptides) 是由動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)特定基因編碼，經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類對細(xì)菌、真菌及病毒等微生物具有殺傷作用的多肽?？咕牟煌诳股氐淖饔脵C(jī)制?？咕膶?xì)菌、真菌、病毒和腫瘤等均有作用，尤其對耐藥性細(xì)菌有殺滅作用，具有廣譜性。 本項(xiàng)目主要涉及4種不同來源抗菌肽工程菌株以及生產(chǎn)工藝。具體為：美洲擬鰈抗菌肽Pleurocidin、果蠅抗菌肽Metchnikowin、假黑盤菌抗菌肽-菌絲霉素Plectasin以及梭魚娃2-RPLX等4種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工程菌株及菌株高效發(fā)酵生產(chǎn)工藝。 技術(shù)指標(biāo)（創(chuàng)新要點(diǎn)等）： 1. 抗菌肽工程菌株的構(gòu)建 2. 抗菌肽的分離純化以及活性鑒定； 3. 抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工藝參數(shù)及流程。 抗菌肽的生物活性主要有抑制或殺滅細(xì)菌作用、抗真菌作用、抗病毒活性、抗寄生蟲作用、免疫調(diào)節(jié)作用以及抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞作用。目前主要應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于作為抗生物替代品用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、飼料工業(yè)、食品工業(yè)。

本發(fā)明涉及一種抗菌肽TO2?24及其應(yīng)用，具體涉及一種抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的序列如SEQ ID No.1所示。該抗菌肽可有效殺傷海岸弧菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌三種魚類致病菌。本發(fā)明的抗菌肽經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證效果優(yōu)異。

本發(fā)明提供了一種魚源抗菌肽hepcidin突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明通對魚源抗菌肽hepcidin的氨基酸序列進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)分析，將其25個(gè)氨基酸中的3處氨基酸進(jìn)行突變，獲得一種新型魚源抗菌肽hepcidin突變體，使其抗菌效力獲得顯著提高。在此基礎(chǔ)上，選用畢赤酵母偏愛密碼子，人工合成新型魚源抗菌肽hepcidin突變體基因，克隆于畢赤酵母中表達(dá)，獲得新型抗菌肽重組酵母菌株，并將發(fā)酵規(guī)模放大到發(fā)酵罐水平，實(shí)現(xiàn)抗菌肽產(chǎn)品的高密度發(fā)酵和高效表達(dá)。發(fā)酵液進(jìn)一步純化后可制成粉劑、液體等抗菌肽制劑，用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑或水產(chǎn)動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療制劑。

齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生的慢性進(jìn)行性破壞性感染性疾病。WHO 將列為僅次于心血管病、腫瘤之后的第三大非傳染性重點(diǎn)防治疾病。變形鏈球菌(Streptococcus mutans，SM)是齲病的主要致病菌，為革蘭氏陽性菌，厭氧或兼性厭氧，抑制其生長可有效治療齲 。變形鏈球菌以生物膜（SM biofilm）的形式存在并致齲。以生物膜形式存在的細(xì)菌與以浮游態(tài)存在的細(xì)菌相比，在代謝特點(diǎn)和生理現(xiàn)象方面存在著眾多明顯的不同點(diǎn)，如對抗菌劑的敏感性、基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)、耐酸性等。細(xì)菌生物膜對

針對飼料、食品、化妝品和生物保鮮劑用防腐劑（抗菌肽）的特點(diǎn)和要求，用分子生物學(xué)手段開展動(dòng) 植物來源防御素和兩棲類動(dòng)物來源抗菌肽（LL-37和HsAFP1）的分子改良和產(chǎn)品研制，獲得對畜牧業(yè)和飼 料工業(yè)主要有害細(xì)菌、真菌和病毒均有高效殺滅作用的廣譜抗菌肽。應(yīng)用重組DNA技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)抗菌 肽的載體，篩選高效表達(dá)的可食用酵母工程菌，并完成產(chǎn)品的制粒、包被等后加工技術(shù)。

本發(fā)明公開了一種丁酸梭菌分泌的抗菌肽及其氨基酸序列和應(yīng)用。所述的抗菌肽氨基酸序列為序列表SEQ?ID?NO:1所示，分子量為2264.6道爾頓，等電點(diǎn)為8.64。其制備方法是：硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中丁酸梭菌分泌的的抗菌肽，利用陽離子交換、分子篩層析和反向高效液相色譜法純化抗菌肽。該抗菌肽具有顯著的抗菌活性，且不會(huì)對豬的紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血作用，可用于開發(fā)制備飼用抗菌藥物。

成果描述：本課題采用理性設(shè)計(jì)的策略，通過基因重組的手段構(gòu)建雜合抗菌肽LfcinB-P-CB，具有活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、無毒等優(yōu)點(diǎn)。通過對抗菌肽工程菌發(fā)酵優(yōu)化，及抗菌肽純化、制劑工藝研究，建立中試規(guī)模的抗菌肽制劑的制備體系?？咕Ч_(dá)到雜合肽LPCB與Amp（50 μg/mL）抑菌直徑之比大于1.0；耐熱性強(qiáng)，在100 ℃條件下維持3 h活性無明顯降低；有一定的耐酸堿性，在pH 2~10的環(huán)境中仍能保持較高的活性；安全性高，對真核細(xì)胞幾乎無溶血性；實(shí)現(xiàn)雜合抗菌肽LfcinB-P-CB在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用，解決抗生素等化學(xué)抗菌材料造成了日益嚴(yán)重的環(huán)境問題，降低某些物質(zhì)會(huì)以原型或代謝物形式排泄造成環(huán)境污染使環(huán)境中出現(xiàn)耐菌株的可能性，從而給人類生存環(huán)境構(gòu)成危害。市場前景分析：據(jù)國外報(bào)道，歐洲各國的養(yǎng)牛業(yè)、養(yǎng)豬業(yè)及養(yǎng)禽場無一例外普遍在配合飼料中添加了上述獸用抗生素作為“動(dòng)物生長促進(jìn)劑”。泰洛星已成為當(dāng)今世界上頭號(hào)獸用抗菌劑，去年泰洛星的銷售額高達(dá)2.75億美元。我國當(dāng)前的動(dòng)物養(yǎng)殖面臨越來越嚴(yán)峻的疫病困擾，因此抗菌肽產(chǎn)品在動(dòng)物保健方面的開發(fā)和應(yīng)用在我國需求巨大。2010年全國動(dòng)物用抗菌肽類產(chǎn)品年銷售額接近一億元，但抗菌肽的總市場容量至少超過100億。因此本項(xiàng)目開發(fā)的抗菌肽具有廣闊的市場前景。與同類成果相比的優(yōu)勢分析：抗菌效果達(dá)到雜合肽LPCB與Amp（50 μg/mL）抑菌直徑之比大于1.0；耐熱性強(qiáng)，在100 ℃條件下維持3 h活性無明顯降低；有一定的耐酸堿性，在pH 2~10的環(huán)境中仍能保持較高的活性；安全性高，對真核細(xì)胞幾乎無溶血性；