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本發(fā)明提供一種人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7突變蛋白，含有Arg198Ile/His200Phe的突變，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。是從人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480cDNA文庫(kù)中選出igfbp7基因編碼序列，然后構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒中，使其能夠在大腸桿菌菌株BL21中表達(dá)IGFBP7蛋白。在該表達(dá)載體的基礎(chǔ)之上，構(gòu)建人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白7突變蛋，轉(zhuǎn)化BL21后表達(dá)純化突變蛋白，指出IGFBP7與胰島素結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。本發(fā)明提供的突變蛋白，制備方法步驟簡(jiǎn)單可行且成功率較高，該蛋白與胰島素的結(jié)合能力有明顯降低，從而可以抑制胰島素抵抗，可在制備治療2型糖尿病藥物中應(yīng)用。

一、項(xiàng)目分類 關(guān)鍵核心技術(shù)突破 二、成果簡(jiǎn)介 蛋白質(zhì)類材料具有良好的生物相容性和優(yōu)異的生物活性，在醫(yī)用材料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。多種材料已在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了其優(yōu)異的生物活性?，F(xiàn)有蛋白材料多從天然生物來(lái)源中提取，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，材料性質(zhì)難以理性設(shè)計(jì)。本技術(shù)利用合成生物學(xué)技術(shù)和化學(xué)修飾技術(shù)，建立了從分子結(jié)構(gòu)到材料性質(zhì)均能理性設(shè)計(jì)的蛋白材料研發(fā)平臺(tái)，發(fā)展了多種具有智能響應(yīng)性和獨(dú)特理化性質(zhì)的生物醫(yī)用蛋白材料，包括具有非天然催化活性的酶制劑、能夠用于傷口修復(fù)和藥物緩釋的可注射蛋白凝膠、多功能靶向抗腫瘤蛋白納米藥物、3D打印蛋白植入材料等。

番茄紅素具有強(qiáng)抗氧化作用，有卓越的防癌、抗癌、預(yù)防心血管疾病等功效，在食品、保健品、化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要用途。目前，國(guó)外已將這一產(chǎn)品廣泛用于食品添加劑、功能性食品、醫(yī)藥原料等方面。2003 年，美國(guó)《時(shí)代》雜志把番茄紅素列在“對(duì)人類健康貢獻(xiàn)最大的食品”之首，番茄紅素由于其優(yōu)越的功能和防癌、抗癌作用，被譽(yù)為“植物黃金”，成為“二十一世紀(jì)醫(yī)藥保健制品 新寵”。 本項(xiàng)目采用生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素，具備了工業(yè)化開(kāi)發(fā)的條件，生產(chǎn)工藝成熟，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，番茄紅素產(chǎn)量可達(dá) 1.5-2.5g/L，處于國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。 創(chuàng)新要點(diǎn) 采用三孢布拉酶菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素，其合成水平高于多種生物體，而且具有生產(chǎn)原料易獲得，不受自然條件限制，周期短和適用工業(yè)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。 

流程模擬技術(shù)已經(jīng)成為過(guò)程開(kāi)發(fā)、設(shè)計(jì)、控制和優(yōu)化等過(guò)程工業(yè)的常規(guī)工具。木質(zhì)纖維素 生物煉制過(guò)程的流程模擬技術(shù)也已成為熱點(diǎn)的研究方向。目前，美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室建立的 基于Aspen plus平臺(tái)的生物轉(zhuǎn)化玉米秸稈生產(chǎn)纖維素乙醇的過(guò)程模擬模型是較為完善的設(shè)計(jì)型 過(guò)程經(jīng)濟(jì)技術(shù)評(píng)價(jià)模型。但是，該模型屬于美國(guó)能源部的內(nèi)部資源，模型所有重要細(xì)節(jié)并未對(duì) 外公開(kāi)。本項(xiàng)目則針對(duì)我國(guó)自主研發(fā)的纖維素生物能源產(chǎn)品和化學(xué)品的工藝過(guò)程，開(kāi)發(fā)了完善 的基于Aspen plus平臺(tái)的過(guò)程流程模擬系統(tǒng)，為生物能源或生物煉制領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化提供重要的 技術(shù)支撐。 本項(xiàng)目的木質(zhì)纖維素生物煉制流程模擬技術(shù)包括完整的生物質(zhì)組分物性數(shù)據(jù)庫(kù)，完整的 纖維素乙醇、纖維素乳酸、纖維素檸檬酸、纖維素葡萄糖酸和纖維素微生物油脂的Aspen plus 經(jīng)濟(jì)技術(shù)評(píng)價(jià)模型。其中，生物質(zhì)組分物性數(shù)據(jù)庫(kù)包括34個(gè)單元操作設(shè)備，75股物流，46種組 分，涵蓋了所有主要的生物質(zhì)組分以及生物加工過(guò)程設(shè)計(jì)的組分；完善的纖維素乙醇、纖維素 乳酸、纖維素檸檬酸、纖維素葡萄糖酸和纖維素微生物油脂的Aspen plus模型則能對(duì)各生物煉 制過(guò)程中的水耗、能耗、廢水排放等重要指標(biāo)進(jìn)行嚴(yán)格的衡算和單元操作優(yōu)化，并能分析相關(guān) 生物煉制過(guò)程產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。同時(shí)，該模型也可拓展到對(duì)其他纖維素基產(chǎn)品生物煉制過(guò)程的 模擬。本項(xiàng)目的實(shí)施將為木質(zhì)纖維素生物煉制的產(chǎn)業(yè)化提供重要的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)參考指標(biāo)。 

已有樣品/n首次實(shí)現(xiàn)利用葡萄糖為原料微生物高效合成燈盞乙素，在3升發(fā)酵罐，發(fā)酵93h，燈盞乙素產(chǎn)量可達(dá)500毫克/升，預(yù)計(jì)近期內(nèi)能達(dá)到3克/升，并已初步建立了提取工藝。燈盞乙素微生物合成技術(shù)與傳統(tǒng)生產(chǎn)方法相比，燈盞乙素生產(chǎn)能不受土地種植面積和植物生長(zhǎng)時(shí)間限制、生產(chǎn)效率不受自然條件限制、對(duì)環(huán)境更加友好、燈盞乙素含量高成份單一、分離提取更容易、成本大幅降低，具有很好的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)燈盞乙素年產(chǎn)量約10噸，隨著國(guó)內(nèi)市場(chǎng)逐年增長(zhǎng)，五年內(nèi)燈盞乙素需求量至少可增長(zhǎng)到70噸，如果國(guó)際市場(chǎng)打開(kāi)，燈盞乙素純品需求

項(xiàng)目的背景及主要用途： 真菌疏水蛋白是由絲狀真菌在生長(zhǎng)的特定時(shí)期分泌的一類具有特殊理化性質(zhì)的分泌型的小分子量、疏水性蛋白質(zhì)，它們可以通過(guò)自我裝配在兩相界面形成兩親性蛋白膜，改變介質(zhì)表面的親水性和疏水性，是已知表面活性最高的蛋白之一，有著很高的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。 真菌疏水蛋白是純天然生物提取制品，無(wú)毒害，無(wú)污染；耐酸堿，抗相變能力強(qiáng)。自我裝配形成有活性的蛋白膜，具有良好的熱穩(wěn)定性和透氣不透水性。由于它的特性，使得它具有眾多優(yōu)點(diǎn)：（1）自

該成果屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。針對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)中出現(xiàn)的飼料短缺及利用率低、抗生素濫用、畜禽糞便不合理排放等問(wèn)題，開(kāi)展了飼用益生菌的篩選、微生態(tài)制劑的研發(fā)、果渣發(fā)酵飼料菌株篩選及發(fā)酵菌劑研發(fā)、果渣發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝優(yōu)化、生物活性飼料喂養(yǎng)效果評(píng)價(jià)等研究，獲得了具備產(chǎn)業(yè)化的飼用優(yōu)良益生菌菌株，建立了高密度發(fā)酵工藝，可實(shí)現(xiàn)活菌數(shù)高達(dá)1013cfu/g的微生態(tài)制劑的生產(chǎn)，可部分或全部替代抗生素；獲得了多株果渣發(fā)酵菌種及發(fā)酵復(fù)合菌劑。建立了蘋果渣生物活性蛋白飼料兩步固態(tài)發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了多菌種協(xié)同發(fā)酵，使發(fā)酵產(chǎn)物富含蛋白質(zhì)、水溶性氨基酸、益生菌和水解酶等多種活性物質(zhì)；建立了微生物制劑中試生產(chǎn)線、果渣發(fā)酵飼料中試生產(chǎn)線。該成果可應(yīng)用于生物活性飼料、替代抗生素類生物添加劑和非糧生物飼料，生物發(fā)酵飼料可以精確到8-15%添加使用。在不增加喂養(yǎng)成本的基礎(chǔ)上，提高肉蛋奶產(chǎn)量及品質(zhì)，降低成本。全省可形成30萬(wàn)噸優(yōu)質(zhì)活性發(fā)酵飼料，應(yīng)用價(jià)值大。  

本技術(shù)首先根據(jù)鴨胸軟骨的化學(xué)組成設(shè)計(jì)了一種用于提取鴨硫 酸軟骨素的新型復(fù)合蛋白酶的基礎(chǔ)配方，并利用復(fù)配酶制備鴨硫酸軟骨素，其 工藝包括鴨胸軟骨骨粉的制備、鴨胸軟骨骨粉的酶解提取、蛋白質(zhì)的沉降、硫 酸軟骨素粉末四個(gè)步驟。本發(fā)明采用了復(fù)配酶解法提取鴨胸軟骨的硫酸軟骨素， 采用新型復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)配，去掉了堿提這一步，在復(fù)配酶使用上也 進(jìn)行了優(yōu)化，其收率比其它方法提高了 20%左右，產(chǎn)品純度達(dá)到 90%~95%。用復(fù) 合酶代替稀堿或濃堿解離軟骨能夠大大降低對(duì)環(huán)境的污染，并且可以有效縮短 生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本、增加了產(chǎn)品收率、提高產(chǎn)品質(zhì)量，填補(bǔ)了該領(lǐng)域的 空白。 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)或者效益預(yù)測(cè):硫酸軟骨素(Chondroitinsulfate，CS)是 D-葡萄糖 醛酸和 N-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單位組成的酸 性黏多糖。硫酸軟骨素具有抗凝血、抗炎癥、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血 脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)體內(nèi)水分、清除自由基和延緩衰老等多種生理功 能，可應(yīng)用于食品、藥品、各種保健品及高檔化妝品中。我國(guó)是全球硫酸軟骨 素產(chǎn)量最大的國(guó)家，占全球產(chǎn)量的 80%以上，年平均產(chǎn)量多于 4000 噸；我國(guó)硫 酸軟骨素主要出口到美國(guó)、歐洲、日本等地，其中美國(guó)作為我國(guó)硫酸軟骨素第 一大出口市場(chǎng)，出口份額約占 50%。所以，隨著硫酸軟骨素生物活性功能不斷研 究及其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，硫酸軟骨素用途越來(lái)越廣，具有廣闊市場(chǎng)應(yīng)用前 景。

研究人員運(yùn)用生物信息學(xué)分析疊加肝癌隊(duì)列標(biāo)本驗(yàn)證證實(shí)CACYBP在肝癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)CACYBP的肝癌病人總生存時(shí)間及無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間更短，預(yù)后更差；而通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及小鼠模型發(fā)現(xiàn)缺失CACYBP的肝癌細(xì)胞株在體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)增殖能力顯著減弱。為了研究CACYBP調(diào)控肝癌生長(zhǎng)的分子機(jī)制，研究人員利用串聯(lián)親和純化連用質(zhì)譜技術(shù)，首次鑒定出環(huán)指蛋白41（RNF41）與CACYBP相互作用，并通過(guò)泛素化實(shí)驗(yàn)及放線菌酮追蹤檢測(cè)證實(shí)RNF41為CACYBP上游特異的E3泛素連接酶，在肝癌細(xì)胞中促進(jìn)CACYBP的降解，且兩者在肝癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CACYBP促進(jìn)Ser10磷酸化使P27Kip1存留在胞漿中，從而加速細(xì)胞周期，促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，而RNF41對(duì)這一過(guò)程具有抑制作用。       該研究結(jié)合生物信息學(xué)分析、肝癌隊(duì)列標(biāo)本、細(xì)胞功能及分子機(jī)制驗(yàn)證，一方面揭示了CACYBP促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)增殖的上下游分子機(jī)制，另一方面為開(kāi)發(fā)新型肝癌診療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

本發(fā)明涉及分子微生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種C型凝集素(C-type?lectin)及其制備和應(yīng)用。C型凝集素為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。制備方法：以許氏平鮋cDNA為模板PCR擴(kuò)增C型凝集素基因，構(gòu)建質(zhì)粒pLecC；將pLecC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Transetta(DE3)，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，收集上清，濃縮后即得重組C型凝集素。所述C型凝集素對(duì)多種弧菌具高效凝集作用，經(jīng)C型凝集素處理后的細(xì)菌對(duì)許氏平鮋的侵染能力顯著降低。因此，該C型凝集素有望應(yīng)用于魚類細(xì)菌性病害的防治。