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G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族是最大的一類膜蛋白家族受體，在視覺，嗅覺，味覺以及激素和神經(jīng)遞質(zhì)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的生理功能，同時(shí)也是關(guān)鍵的藥物靶標(biāo)。近年來，隨著越來越多GPCR在失活和激活狀態(tài)下的晶體及電鏡結(jié)構(gòu)的解析，人們對(duì)于這一大類受體的激活機(jī)制有了愈發(fā)深入的了解。然而，GPCR受體的失活和激活結(jié)構(gòu)僅代表了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程起始和終止時(shí)相對(duì)穩(wěn)定的構(gòu)象狀態(tài)，受體在激活過程中發(fā)生了復(fù)雜多樣的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化，這些變化很可能與不同配體引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多樣性相關(guān)。目前，GPCR在激活過程中的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化仍不清楚，國(guó)際上這方面的研究尚處于起步階段。液體核磁共振方法能夠在原子分辨率水平研究蛋白質(zhì)相互作用和構(gòu)象變化，提供晶體或電鏡結(jié)構(gòu)缺失的信息，是GPCR動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)與激活機(jī)制研究中不可缺少的重要研究手段。 M2毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M2R）是一個(gè)典型的GPCR，在調(diào)節(jié)人體心率和許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用，是研究GPCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)以及藥物設(shè)計(jì)的模式受體。該項(xiàng)研究通過在M2R中引入13CH3-ε-甲硫氨酸同位素標(biāo)記探針，檢測(cè)受體在結(jié)合一系列配體小分子時(shí)的核磁圖譜變化（圖一），分析M2R動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化與這些配體對(duì)G蛋白激活和抑制蛋白 （arrestin）招募效應(yīng)差異的相關(guān)性。同時(shí)，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步解釋不同配體結(jié)合導(dǎo)致受體激活時(shí)構(gòu)象和功能變化差異的分子機(jī)制。該項(xiàng)研究首次將M2R的配體結(jié)構(gòu)、受體構(gòu)象變化以及配體功能多樣性聯(lián)系起來，揭示了M2R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多樣性可能的分子機(jī)制，并為針對(duì)這類重要受體的藥物研發(fā)提供了理論指導(dǎo)。

高效的 多肽 - 多肽偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)于 制備蛋白 - 藥物綴合物、調(diào)控蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、生物成像 、化學(xué)生物學(xué) 等 領(lǐng)域 具有重要的意義 ，并因其可基因編碼的特性 而 備受關(guān)注 。目前， 研究 報(bào)道 此類連接方法 并不太多 見 ，其中 分選酶（ sortase ） 或 蝶豆粘酶 -1 （ butelase 1 ） 介導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)具有較好的底物 序列特異性 ， 內(nèi)含肽 （ intein ） 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接方法 可實(shí)現(xiàn) 可基因編碼的高效主鏈連接， 而 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 （ transglutaminase ） 則 可以 介導(dǎo) 非特異性的 側(cè)鏈異肽鍵 偶聯(lián) 。近年來 ， 多肽 - 蛋白質(zhì)反應(yīng)對(duì) 的 蓬勃發(fā)展 為此類工具 的 發(fā)展 提供了新的契機(jī) 。 已 有 諜連接酶（ SpyLigase ）和探連接酶（ SnoopLigase ） 介導(dǎo) 的多肽 - 多肽偶聯(lián)體系 見諸報(bào)道 ，但其效率仍 有 待提高， 而 其 細(xì) 胞內(nèi)的應(yīng)用前景仍有待探索。 最近 ， 張文彬課題組發(fā)展了 獨(dú)特的具有無序結(jié)構(gòu)的 諜訂書機(jī) 酶 （ SpyStapler ），可實(shí)現(xiàn) 諜標(biāo)簽 （ SpyTag ）和北大 標(biāo)簽 （ BDTag ）在 細(xì) 胞內(nèi)和 細(xì) 胞外的高效偶聯(lián) （圖 1 ） 。

相對(duì)于人類病原微生物，生物防微生物與宿主互作的分子機(jī)理研究起步較晚。對(duì)殺蟲防病功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，不僅對(duì)揭示這些蛋白分子的作用機(jī)理具有重要意義，同時(shí)也是構(gòu)建新型高效廣譜微生物農(nóng)藥的基礎(chǔ)。本項(xiàng)目選擇我國(guó)分離的蘇云金芽胞桿菌中具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要的殺蟲功能基因，通過解析其蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和開展生物學(xué)功能研究，揭示這些蛋白質(zhì)的分子作用機(jī)理。同時(shí)進(jìn)行蛋白與昆蟲中腸蛋白的互作，以明確其在昆蟲中腸的作用靶點(diǎn)，為分子設(shè)計(jì)此類蛋白以提高毒力和擴(kuò)大殺蟲譜提供科學(xué)的理論依據(jù)。

一、成果簡(jiǎn)介 眾所周知，皮膚的狀態(tài)與人的外表緊密相連。良好的皮膚狀態(tài)讓人看起來更年輕、漂亮。人們?cè)谧o(hù)膚養(yǎng)顏產(chǎn)品上的消費(fèi)占日常消費(fèi)很大的比重。在美容養(yǎng)顏上，近年來膠原蛋白類產(chǎn)品備受爭(zhēng)議，公眾對(duì)膠原蛋白美容 養(yǎng)顏功效產(chǎn)生質(zhì)疑。有營(yíng)養(yǎng)專家甚至表示：膠原蛋白根本沒有美容功效，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值還不如牛奶雞蛋。口服膠原蛋白產(chǎn)品是否可以美容？哪些因素影響膠原蛋白產(chǎn)品的美容效果？據(jù)報(bào)道，國(guó)外的相關(guān)產(chǎn)品采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和

具有哮喘治療潛能的血管活性腸肽-人血白蛋白融合技術(shù)是李紅玉教授團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)數(shù)年，研發(fā)的一種生物融合蛋白技術(shù)。該技術(shù)受到人vip（血管活性腸肽）具有抗炎、調(diào)免疫、舒張支氣管的生理活性的啟迪，再依據(jù)支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，將 vip 和 HSA（人血白蛋白）制成融合蛋白用來治療哮喘，即克服了 vip 半衰期短的缺點(diǎn)為其臨床的應(yīng)用提供可能，又為哮喘的臨床治療提供更多候選藥物。同時(shí)將融合蛋白制成噴劑還可以克服 vip 多種生理活性所致的系統(tǒng)性副作用。該技術(shù)的產(chǎn)品融合蛋白經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，體內(nèi) Wistar 哮喘模型

本發(fā)明所構(gòu)建的融合蛋白 EAMM 能在大腸桿菌中穩(wěn)定大量表 達(dá)，經(jīng)純化得到純度較高的蛋白;構(gòu)建的亞單位疫苗免疫動(dòng)物能產(chǎn)生 針對(duì)結(jié)核桿菌特定抗原(ESAT-6、Ag85B、Mtb8.4 和 PPD)的特異 性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，具有較強(qiáng)的免疫原性。EAMM 亞單 位疫苗加強(qiáng)免疫后的結(jié)核菌載量明顯少于 PBS 組和僅 BCG 免疫組， 表明清除結(jié)核分枝桿菌的能力較強(qiáng)。從組織切片 HE 染色

采用高效預(yù)處理、低溫酶萃取、鹽析和膜分離等成套技術(shù)，從新鮮動(dòng)物皮、魚皮、魚鱗等不同原料中制備未變性膠原蛋白，解決了獲取大量高純度、未變性的化妝品用和醫(yī)用生物活性膠原的技術(shù)難題；掌握了通過物理與化學(xué)改性手段調(diào)控未變性膠原的熱穩(wěn)定性、流變學(xué)等性能的方法和原理，為未變性化妝品用和醫(yī)用膠原的產(chǎn)業(yè)化利用提供了技術(shù)支撐。目前，化妝品用和醫(yī)用生物活性膠原蛋白生產(chǎn)技術(shù)已分別在成都新際生物活性膠原開發(fā)有限公司和廣東勝馳生物科技有限公司成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，產(chǎn)品技術(shù)參數(shù)與天然膠原標(biāo)準(zhǔn)品一致，經(jīng)濟(jì)效益顯著，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

本發(fā)明所構(gòu)建的融合蛋白EAMM 能在大腸桿菌中穩(wěn)定大量表達(dá)， 經(jīng)純化得到純度較高的蛋白；構(gòu)建的亞單位疫苗免疫動(dòng)物能產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核桿菌特定抗原（ESAT-6、Ag85B、Mtb8.4和PPD）的特異性的細(xì)胞 免疫和體液免疫應(yīng)答，具有較強(qiáng)的免疫原性。

本發(fā)明公開了一種新型的酸化蛋白飼料補(bǔ)充料，所述酸化蛋白飼料補(bǔ)充料由檸檬酸菌絲體、玉米蛋白粉和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控劑以質(zhì)量比為1：1～2：0.05～0.1組成；所述營(yíng)養(yǎng)調(diào)控劑為碳酸鈣、賴氨酸和酵母培養(yǎng)物以質(zhì)量比1：0.5～1：3～5構(gòu)成；本發(fā)明新型的酸性蛋白飼料補(bǔ)充料不僅大大提高其蛋白含量，而且具有酸香味，適口性好，能明顯改善畜禽胃腸道環(huán)境、維持動(dòng)物腸道優(yōu)勢(shì)菌群，減少仔豬腹瀉率，提高畜禽生產(chǎn)性能；酸化蛋白飼料補(bǔ)充料應(yīng)用方便，可以直接等量替代畜禽配合飼料中的玉米和豆粕，替代上限為20%，不需要另行調(diào)整配方，就能保持原有營(yíng)養(yǎng)水平和生產(chǎn)性能。

角蛋白酶是一種特異性蛋白酶類，可降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜、硬質(zhì)難溶的角蛋白，具有多種優(yōu)良的催化特性，在生物加工、綠色制藥、廢棄生物質(zhì)處理、生物制革、生態(tài)紡織、洗滌劑等實(shí)際應(yīng)用中備受關(guān)注，被認(rèn)為是有著巨大應(yīng)用潛力和市場(chǎng)前景的新一代蛋白酶類。 本項(xiàng)目從角蛋白酶基因挖掘、高效表達(dá)、性能改造及其應(yīng)用研究等方面開展了一系列工作。課題組目前建立了角蛋白酶資源庫(kù)，是我國(guó)擁有角蛋白酶基因資源產(chǎn)權(quán)最多和最具多樣性來源的單位；實(shí)現(xiàn)了角蛋白酶基因在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌等外源宿主中的克隆及高效表達(dá)；在 5L 罐上發(fā)酵酶活最高可達(dá)10000 U/mL 以上，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的重組角蛋白酶表達(dá)最高水平；項(xiàng)目已完成了 1M3 規(guī)模中試試驗(yàn)，成本降低 30%以上。在應(yīng)用方面，本項(xiàng)目成功將角蛋白酶用于生物法制備納米銀粒子 AgNPs，與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，酶法合成的納米銀具有更好的抑菌活性。另外，項(xiàng)目組已首次開發(fā)出無膠原活力的高特異性角蛋白酶，具有高角蛋白活力，不會(huì)對(duì)皮革膠原造成破壞，能保護(hù)膠原結(jié)構(gòu)完整性，可開發(fā)出不傷及皮膚真皮的洗滌劑產(chǎn)品、藥品及化妝品，在生物制革領(lǐng)域也具有極大應(yīng)用價(jià)值，可緩解制革工業(yè)中的爛皮現(xiàn)象；同時(shí)本研究所開發(fā)的角蛋白酶在活性多肽制備中也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。