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基于CRISPR/Cas9基因編輯系統的載體組合及其應用
01.成果簡介 CRISPR/Cas9是細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統。其工作原理是crRNA通過堿基配對與tracrRNA結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。經過研究，通過人工設計tracrRNA/crRNA，改造形成具有引導作用的sgRNA，可以引導Cas9蛋白在多種細胞的特定基因組位點上進行切割、修飾，并最終實現基因突變、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系統已經被廣泛應用于基因編輯技術領域。 近年來，CRISPR/Cas9基因編輯系統在真核生物和原核生物中得到了廣泛的應用。在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，用一個載體表達cas9基因，同時由于革蘭氏陰性菌重組效率低，需要在這個載體上表達λ-RED重組酶；在另一個載體中表達sgRNA和用于同源重組的同源臂序列。兩個載體都轉入大腸桿菌中時，sgRNA介導Cas9蛋白切割基因組上特定序列，形成雙鏈斷裂，刺激同源重組的發生，從而實現基因編輯。 本項成果構建了適用于鹽單胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統。該系統由兩個載體組成：第一個載體表達Cas9基因，且不需要表達λ-RED重組酶，實際操作中不再需要誘導λ-RED重組酶的表達，簡化了步驟流程；第二個載體表達sgRNA，并含有用于同源重組的同源臂序列。從而實現了基因編輯。本項成果的技術優勢包括： （1）基因編輯時間由原有的20余天縮短到7-8天； （2）N個基因編輯時間由原有的N個月縮短到3+5N天； （3）無需表達λ-RED重組酶。 圖1 鹽單胞菌TD01進行基因編輯的流程示意圖02.應用前景 本項成果可作為CRISPR/Cas9基因編輯系統的載體，廣泛應用于基因編輯領域。03.知識產權 本項成果已申請1項發明專利。04.團隊介紹 本項目為多團隊合作項目，其中一個團隊的負責人為清華大學教授，博士生導師，長江學者特聘教授，國家杰出青年基金獲得者。主要研究方向為合成生物學、微生物代謝工程、生物材料、工業生物技術。已發表國內外高水平學術論文數十篇，申請專利70余項。05.合作方式 投融資。06.聯系方式郵箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn
清華大學
2021-04-13
家蠶滯育品種的低溫和早期浸酸催青轉基因方法
一種家蠶滯育品種的低溫催青轉基因方法。用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性,使 特殊的催青條件下獲得的當代家蠶滯育品種蠶蛾交配，產下非滯育的下一代蠶卵，最后參照非滯育家蠶卵胚 胎顯微注射的轉基因方法進行轉基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉基因技術的障礙并有效制作轉基因 蠶。該方法直接采用生產中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過 程，直接利用轉基因技術創造出各種性狀優良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節約大量的人 力和物力。一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉基因方法，利用在蠶卵胚胎發育至胚帶形成之前的一定時間內， 即產卵后2個半小時之前對家蠶滯育卵進行鹽酸的浸泡處理,隨后對處理解除滯育的蠶卵進行風臺顯微注射， 催青孵化獲得的GO代家蠶的飼養至化蛾，它們的自交或回交產生G1代，通過熒光標記篩選，從而有效制作 轉基因家蠶。該方法直接采用生產中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的 育種過程,直接利用轉基因技術創造出各種性狀優良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節約大 量的人力和物力。
西南大學
2021-04-13
一種基因工程紅球菌及其構建方法與應用
1. 痛點問題
紅球菌是具有高抗逆性（耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產丙烯酰胺——其聚合產物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領域——迄今為止仍是工業生物技術領域最成功的案例之一。開發紅球菌基因編輯方法，一方面可以實現紅球菌細胞自身性能的按需調控（如敲除副產物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細化學品生產中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細胞為普適性宿主，高表達各種外源功能酶，從而實現重組紅球菌全細胞催化技術的普遍應用，尤其是解決手性醫藥中間體現有制備工藝中路線長、工藝復雜、原子經濟性差、環境污染嚴重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉化率低、非法重組嚴重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質粒介導的同源重組，但自殺質粒轉化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發高效的紅球菌基因組編輯工具。
2. 解決方案
本技術核心成果是一種基于CRISPR（成簇規律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術通過紅色紅球菌特有啟動子及質粒元件，首先實現了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達及切割功能；其次成功規避了紅球菌的限制修飾系統，將紅色紅球菌基因轉化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統，不僅可以實現基因組上目標基因的敲除、替換和改造，也可實現多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細胞催化平臺技術開發及其在化學品綠色先進制造中的應用奠定了堅實基礎。
合作需求
開展合作開發、技術許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應用領域進行紅球菌全細胞催化法生產目標產品的企業合作，尤其是在上述不同領域具有生產和銷售優勢或經驗的企業。
清華大學
2021-12-16
創制轉基因技術中帶有安全篩選標記的安全轉化載體
選擇標記轉基因作物已成為近年來植物基因工程技術研究的重點之一，隨著轉基因作物產品的商品化，轉基因植物的生物安全性受到公眾越來越多的關注，尤其是目前抗生素標記基因在植物遺傳轉化過程中的廣泛應用，使人們對這些標記基因可能帶來的潛在危害性心存疑慮，抗性標記基因的存在嚴重地阻礙了轉基因植物的商品化進程和轉化技術本身的有效性。 本項目培育的無抗生素標記基因（可視化標記基因）在建立高效、安全、規模化的轉基因作物技術體系方面取得突破，以紫色幼芽作為可視篩選標記代替抗生素篩選標記，構建了新型轉化載體
南開大學
2021-04-14
Chordin A基因在湘軍金魚雙尾性狀中的作用機制研究
本試驗通過石蠟切片技術對湘軍金魚性腺組織進行切片觀察，發現9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。
一、項目進展
創意計劃階段
二、負責人及成員
姓名
學院/所學專業
入學/畢業時間
洪迪珊
湖南師范大學生命科學學院/生物科學
2018/2022
陳雨薇
湖南師范大學生命科學學院/生物技術
2018/2022
劉雨欣
湖南師范大學生命科學學院/生物科學
2019/2023
馬彤彤
湖南師范大學生命科學學院/生物科學
2019/2023
黃志嫻
湖南師范大學生命科學學院/生物科學
2018/2022
三、指導教師
姓名
學院/所學專業
職務/職稱
研究方向
劉少軍
湖南師范大學生命科學學院/魚類遺傳育種
教授
魚類遺傳育種
王余德
湖南師范大學生命科學學院/魚類遺傳育種
講師
魚類遺傳育種
四、項目簡介
為探究湘軍金魚的胚胎發育過程、能育性、倍性以及Chordin A基因在湘軍金魚的雙尾性狀形成過程中的作用，本試驗通過石蠟切片技術對湘軍金魚性腺組織進行切片觀察，發現9月齡的雄性湘軍金魚精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚卵巢中有成熟卵子。試驗通過PHA體內誘導腎細胞制片法對湘軍金魚染色體數目進行統計，發現其染色體數目為100條。試驗通過PCR技術獲得了Chordin A基因全長，并對其進行生物信息學分析發現Chordin A基因全2634 bp，其中堿基A共618個，占比23.46%、堿基C共692個，占比26.27%、堿基G共756個，占比28.70%、堿基共568個，占比21.56%。堿基“G+C”占比 54.97%，堿基“A+T”占比45.03%。試驗對湘軍金魚不同組織進行Chordin A基因的熒光定量PCR試驗，發現Chordin A基因在尾鰭表達量最高。項目成員在進行科學探究的同時深挖湘軍金魚經濟價值，項目組成員多次赴雙峰縣、龍田鎮玉坪村等地進行實地調研,我們發現觀賞魚行業是朝陽行業，發展迅猛；與此同時湖南省休閑漁業來勢喜人，但是觀賞魚普遍魚病高發，變異物種破壞生態等問題。本項目借助湘軍金魚這一優質魚種，通過互聯網+農副產品的銷售模式，變單一銷售模式為多形式利益聯合，拉動當地的經濟增長。我們與村落達成了長期合作的關系。湘軍金魚作為優質觀賞魚備受消費者青睞。
湖南師范大學
2022-08-10
轉基因沉默延長香石竹切花品種的瓶插壽命技術
可以量產/n由于香石竹是乙烯敏感植物，在其采后貯藏運輸期間需花費大量的人力物力進行保鮮處理。傳統的保鮮方法多采用含有乙稀抑制劑(如AVG、GVG、AOA)和乙稀拮抗劑(如AgNO3、STS、2,5-NBD)的保鮮劑，或是利用冷藏、氣調等措施，不僅成本高，效果也不盡人意，且易造成環境污染。本成果運用轉基因沉默理論，通過基因工程的方法抑制香石竹內源乙烯的生物合成，從而達到延長香石竹自然保鮮期的目的，進而達到有效調節貯運和香石竹市場供應之目的。技術水平：利用轉基因技術獲得了瓶插壽命明顯延長的香石竹切花'M
華中農業大學
2021-01-12
基于基因組定點編輯分子育種新技術及其配套軟件
研發階段/n基于基因組定點編輯分子育種新技術及其配套軟件。 成果簡介：本成果含有完整的基于CRISPR/Cas系統介導的基因組定點編輯技術，我們對基因組編輯技術切割活性和脫靶效應進行了優化，開發了完整的sgRNA設計，sgRNA表達載體構建，細胞或在體水平基因組打靶和脫靶檢測等技術。提高基因組定點打靶效率和降低脫靶風險，為基因組定點編輯技術應用于動植物分子育種打開了新的局面。本成果擁有自主知識產權的基因組編輯技術配套軟件，其適用于針對不同物種基因組設計和篩選活性高，特異性強的sgRNA用于動植物分
華中農業大學
2021-01-12
基因轉錄延伸復合體形成及作用機制的研究
東南大學生命科學與技術學院“發育與疾病相關基因”教育部重點實驗室林承棋和羅卓娟課題組在國際頂級期刊Science Advances雜志發表了題為ENL initiates multivalent phase separation of the Super Elongation Complex (SEC) in controlling rapid transcriptional activation的文章，闡明了有關基因轉錄延伸復合體形成及作用機制的研究工作成果。
基因轉錄是承載于DNA之上遺傳信息傳遞的首要步驟。細胞命運決定、個體發育以及疾病的發生發展決定于基因的差異性表達。林承棋教授之前的研究鑒定并發現，多亞基、大分子蛋白質復合物，超級轉錄延伸復合物（SEC）可通過磷酸化RNA聚合酶II等因子，讓其從暫停的狀態中釋放出來，促進下游基因進行有效的轉錄。然而，長期以來，人們困惑于細胞內膜系統之外的分子如何有序活動調控生命過程。
東南大學研究團隊的研究揭示了SEC介導的多價相分離在RNA聚合酶II轉錄暫停釋放中起著關鍵作用，并從全新的角度為基因快速協調性轉錄激活程序的機制探索提供了新的認識。此外，作者還發現在混合譜系白血病（MLL）中，SEC與MLL基因的轉位融合，可以極大促進SEC相分離，從而促進癌基因快速轉錄并維持高表達狀態。這一發現將為SEC相關的人類疾病發病機制探索及藥物靶向篩選方案提供了新的方向與思路。
本文第一作者為東南大學生命科學與技術學院林承棋課題組博士生郭澄豪，東南大學為第一通訊單位。
東南大學
2021-04-11
創制轉基因技術中帶有安全篩選標記的安全轉化載體
選擇標記轉基因作物已成為近年來植物基因工程技術研究的重點之一，隨著轉基因作物產品的商品化，轉基因植物的生物安全性受到公眾越來越多的關注，尤其是目前抗生素標記基因在植物遺傳轉化過程中的廣泛應用，使人們對這些標記基因可能帶來的潛在危害性心存疑慮，抗性標記基因的存在嚴重地阻礙了轉基因植物的商品化進程和轉化技術本身的有效性。
本項目培育的無抗生素標記基因（可視化標記基因）在建立高效、安全、規模化的轉基因作物技術體系方面取得突破，以紫色幼芽作為綠 膿可視篩選標記代替抗生素篩選標記，構建了新型轉化載體并應用于作物，已申請 2 項發明專利。
南開大學
2021-04-13
利用抗除草劑基因的油菜化學殺雄制種技術
該發明屬于農作物標記輔助育種技術領域，具體涉及利用抗除草劑基因的油菜化學殺雄制種方法。該發明提出了一個改良程序，能夠簡化的、安全的以及經濟的利用化學殺雄制種的方法：即在無遮擋措施條件下，利用除草劑苯磺隆的同時處理（噴施相同濃度的苯磺隆溶液）父母本，允許母本植株雄性不育，父本植株（攜帶又除草劑抗性基因）雄性可育。該程序主要特點是既可以保證優良雜交種的安全生產，又可以允許化學殺雄劑苯磺隆規模化噴施（不需要在遮擋條件下保護父本）可以降低生產成本，提高雜種優勢利用在生產甘藍型油菜雜交種的效率。
市場預期：該成果具有良好的市場前景，可以同時降低油菜化學殺雄制種的風險以及成本。
轉化條件：制種試驗田、苯磺隆除草劑以及實施田間除草劑處理的機械等。
成果完成時間：2016年
華中農業大學
2021-01-12